PCP通路相关基因罕见变异及异常甲基化与胎儿无脑畸形的关联研究

Anencephaly (AN) is a kind of common congenital malformations with high rate of lethality that often lead to perinatal deaths. It is a condition that prevents the normal development of the brain and the bones of the skull. The etiology of AN remains poorly understood. Up to 50% of the variance in AN prevalence attributes to genetic factors. In the proposed research project, we aim to examine the association of AN with new rare variants and aberrant DNA methylation in planar cell polarity (PCP) pathway genes, by using case-control study based on nuclear family. Cases are fetuses terminated due to prenatal diagnosis of an AN and controls are fetuses terminated not for birth defects. Then, functional analysis will be conducted by using both human study and cell culture study. Co-Immunoprecipitation and yeast one-hybrid system will be performed to explore the effect of new variants on interaction between protein-protein and protein-DNA, respectively. In the human case-control study, protein and mRNA expression of candidate gene will be assayed in the brain tissues of cases and controls, and the differential expression will be determined. The proposed research project will partly discover the genetic and epigenetic mechanism in PCP pathway contributing to the development of AN.

无脑畸形（anencephaly, AN）是一类具有高致死性的先天性神经管缺陷，是导致围产儿死亡的主要原因之一，主要表现为胎儿有少量的神经组织但头盖骨结构全部或部分缺失。AN病因复杂，尚不完全清楚。研究显示遗传因素占全部病因的50%以上。本项目采用基于核心家系的病例对照研究，病例为引产AN患儿，对照为引产无缺陷胎儿，对细胞平面极化通路(planar cell polarity, PCP)相关基因进行罕见变异和甲基化分析，以期发现与AN发生相关的新变异位点。同时，对新变异位点进行细胞水平和人群研究两方面的功能分析。细胞水平研究采用免疫共沉淀和酵母单杂交方法，分析目标基因新变异对蛋白质间或蛋白质-DNA间相互作用的影响；人群研究采用病例对照方法，检测病例和对照胎儿脑组织目标基因mRNA及蛋白的表达水平，分析表达差异性，揭示AN发生的分子遗传及表观遗传学机制。

神经管缺陷(neural tube defects, NTDs)是由于胚胎发育28天前神经管闭合障碍导致的一类出生缺陷，包括无脑、脊柱裂等表型。无脑畸形（anencephaly, AN）是因其具有高致死性，是导致围产儿死亡的主要原因之一，主要表现为胎儿有少量的神经组织但头盖骨结构全部或部分缺失。NTDs被认为是一种复杂的遗传性疾病，然而在遗传因素的作用在很大程度上仍然是未知的。.在本研究中，使用来自510个NTD病例的DNA样本进行靶向二代测序从而在靶向基因的整个编码区和内含子-外显子边界中筛选DNA突变位点。候选基因为PCP通路基因。结果发现6例NTD病例分别携带了PCP通路的双基因变异，如CELSR1&SCRIB，CELSR1&DVL3，和PTK7&SCRIB。而在正常人群没有发现此类双基因突变。表明基因突变可能以双基因相互作用的方式导致NTD表型的发生。本研究通过针对456例NTDs病例和459例正常对照，采用二代测序及高通量基因分型，分析了平面细胞极化通路（PCP通路）基因变异。结果发现位于SCRIB 基因上的rs6558394位点，在显性模式下AG& GG基因型与AA基因型相比，增加了NTDs发生的风险。采用二代测序技术检测，比较神经管缺陷患儿病变处和脐带组织及其他器官组织的DNA序列变异，进一步发现NTDs的发生不仅与SCRIB基因来源于父母的突变有关，还与体细胞突变有关。本研究通过检测46名病例和23名对照的基因甲基化水平，研究发现脊柱裂和无脑儿的病变处组织GRHL3基因的甲基化水平均低于对照组。斑马鱼实验表明grhl3基因功能缺失及该基因过表达均影响斑马鱼汇聚延伸过程，导致神经管缺陷相关表型，包括体轴缩短和卷曲。中枢神经系统组织中GRHL3基因低甲基化与NTDs的发生有关。.本研究揭示了无脑及脊柱裂在中国汉族人群发病的遗传学因素与分子机制，为NTDs发生的遗传机制提供新的思路。在对个体的研究意义上，可以为NTDs高危家庭提供更为精确的遗传风险预测，并为个体化疾病预防提供科学依据；在对群体的研究意义上，为补充与完善我国现行预防与控制出生缺陷政策提供有意义参考数据。

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