铝胁迫下大豆根系柠檬酸分泌相关基因功能分析

Aluminium (Al)-induced citrate secretion is one of the most important Al resistance mechnisms in soybean. Our previous microarray analysis has identified some Al-responsive genes putatively involved in Al-induced citrate exudation. On that base, the present project selects fourteen genes in six groups and will peform following studies: ⅰ) Genes related to Al-induced citrate release will be cloned and their temporal and spatial transcription expression will be analysized by quantitative real time PCR. Their sub-cellular location will be studied by transient expression in onion epidermal. Single or fused two candidate genes will be transformed into soybean hairy roots mediated by Agrobacterium rhizogens. Luceriferse is the reporter gene and the protein expression will be monitored by Centro LB 960 luminometer. Physioligical charateristics such as Al content, relative root elongation and Al-induced citrate secretion rate will be compared in the transgenic hairy roots; ⅱ)Yeast two hybrid will be performed among citrate efflux related genes. Some genes such as citrate transporter will be constructed into bait plasmid and their interaction proteins will be selected within a constructed soybean cDNA library by membrane yeast two-hybrid technique. Totally, the present project will facilitate to understand the functions of genes related to citrate efflux in soybean, the molecular mechanism of Al-induced citrate secretion and and provide the gene resource for breeding Al resistant soybean cultivars.

铝（Al）诱导大豆根系分泌柠檬酸是大豆最重要的抗Al机制之一。本项目选择前期基因芯片鉴定的6类14个可能与Al诱导柠檬酸分泌相关的基因，开展以下研究ⅰ)克隆基因，分析其时空转录表达模式及亚细胞定位，以萤光素酶（Luc）为报告基因，利用发根农杆菌介导转化单个或串联基因至大豆，实时定量监测转基因发根Luc蛋白的表达进而分析候选基因的蛋白表达模式，并分析发根的柠檬酸分泌等生理特征；ⅱ)通过酵母双杂研究候选基因之间的蛋白互作，利用已构建的大豆根尖cDNA酵母文库，筛选柠檬酸转运体等的互作蛋白。通过上述研究，解析Al诱导大豆根系柠檬酸分泌相关基因的功能及其协调模式，揭示Al诱导柠檬酸分泌分子机制及其调控过程，为大豆抗Al新品种的创制储备基因资源。

铝诱导大豆柠檬酸分泌是大豆最重要的抗Al机制。依据立项申请及阶段进展，本项目共分析了以下括6类共20个与大豆抗铝相关基因，他们分别是： MATE家族包括等4个同源基因，转录因子GmSTOP1的5个同源基因，与柠檬酸代谢相关基因GmME1，GmCS1，GmPEPC1及蛋白激酶相关基因GmFERL和GmNEK4L,线粒体膜上转运相关基因GmDTC1，与蛋白降解相关联的GmEBF1和GmEBF2等，与细胞壁相关联的糖基转移酶GmGT1，GmGT2，GmGT3。从基因的时空、专一性表达、基因型差异及组织定位工作，并基本完成上述基因的亚细胞定位工作，大部分基因均已通过在大豆发根和拟南芥中超表达分析其与柠檬酸分泌的关系，同时，部分基因如MATE家族基因、GmSTOP1a在拟南芥上突变体atmate 或atstop1中回复表达进一步进行功能验证。.本项目利用酵母单杂交方法，分析了转录因子GmSTOP1a对MATE家族基因、苹果酸转运体GmALMT1的调控。利用MATE家族3个蛋白，以及GmSTOP1a转录因子分别作诱饵，利用酵母双杂交cDNA文库、pull down及免疫共沉淀等实验进行互作蛋白筛选，但至今未筛选到互作的蛋白。在此情况下，本项目新增加了铝胁迫下大豆根尖比较磷酸化组学研究，明确大豆部分抗铝基因编码蛋白的修饰情况。.通过上述研究，明确的研究结论包含：1、GmME1通过对三羧酸循环的补充反应而提高铝胁迫下大豆根系苹果酸和柠檬酸浓度，进一步提高铝诱导根系柠檬酸和苹果酸的分泌而提高抗铝性;.2、 鉴定大豆三个柠檬酸转运体在铝诱导大豆根系柠檬酸分泌中起重要作用，而三个基因转录表达不同而在柠檬酸分泌的专一性、基因型差异和时间上贡献不同；.3、大豆基因组中五个GmSTOP1基因均响应于铝胁迫，定位于细胞核中且具有转录活性，其中GmSTOP1a具有AtSTOP1的部分调控抗铝和低pH的功能；且发现GmSTOP1对柠檬酸转运体及苹果酸转运体基因的调控。.4、通过比较磷酸组学鉴定到一系列的抗铝蛋白的磷酸化，表明磷酸化过程在大豆抗铝中的重要作用。.其他基因功能需补充一定实验以完善文章发表。.通过以上研究，解析铝诱导大豆根系柠檬酸分泌相关基因的功能、揭示铝诱导柠檬酸分泌分子机制及其调控过程，为进一步掲示大豆抗铝机制提供科学支撑。

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