血清miRNA作为恶性星形细胞肿瘤无创伤性分子标记物的筛选研究

恶性星形细胞肿瘤是最常见的脑瘤之一，中位生存期低，目前尚无特异的生物标志物。微小核糖核酸（miRNA）是一类参与基因转录后水平调控的小分子RNA。我们近期研究发现，人血清存在丰富而稳定的miRNA，其表达水平与食管癌、肺癌等肿瘤密切相关，恶性星形细胞瘤患者血清miRNA表达谱与正常人也有明显不同，提示血清miRNA具无创伤性分子标志物的潜能。本项目拟在前期研究基础上，运用全基因组Solexa 测序扫描和定量PCR验证相结合的手段，通过大样本量临床标本检测分析，筛选出在恶性星形细胞瘤诊断、疗效监控、预后等方面有临床价值的血清miRNA；再利用胶质瘤大鼠脑内种植模型体内试验研究miRNA的早期诊断价值；并进一步通过体外细胞实验探讨miRNA对瘤细胞增殖、浸润和凋亡等的影响，分析其靶基因和可能的作用途径。以期为利用血清miRNA改善该类疾病的诊疗效果提供理论基础和试验依据。

高级别脑恶性星形细胞肿瘤（WHO Ⅲ～Ⅳ级）预后差，复发率100%，是中枢神经系统最常见也是发病率最高的原发性肿瘤，而目前缺乏非创伤性的血清诊断标志物。最近研究显示，血清miRNA可作为一种新的无创伤性肿瘤标志物的潜能。但是目前尚未见星形细胞肿瘤患者的相关报道。本项目运用高通量的Solexa测序技术对高级别星形细胞瘤患者和年龄、性别匹配的正常人组成的两份混合血清中全基因组miRNA进行测序和表达量测定。发现患者与正常血清miRNA表达谱有明显差异，其中50种miRNA在患者中的拷贝数与对照相比差异在2倍以上（35种下降，15种上升）。再运用RT-qPCR技术对差异表达的miRNA分别在复筛组和验证组的单个血清样本中进行验证，证实7种miRNA，包括miR-15b*、miR-23a、miR-133a、miR-150*、miR-197、miR-497和miR-548在高级别星形细胞瘤患者血清中显著降低（P<0.001）。进一步发现这7种miRNA在低级别恶性星形细胞瘤（Ⅱ级）患者血清中的含量也明显降低（P<0.001）。将这7种miRNA组合在一起对Ⅱ～Ⅳ级以及单独Ⅱ级星形细胞瘤诊断的敏感性和特异性分别为88.00%和97.87%, 92.73%和97.87%。提示这7种miRNA对恶性星形细胞瘤具有较高的诊断及早期诊断准确性。而7种miRNA中的5种在其他原发性脑瘤患者患者血清中的含量与正常对照无显著差异。7种miRNA在所有患者术后血清中的含量均显著高于相应的术前（P<0.001）。另外，与在血清中的变化一致，这些miRNA在患者癌组织的表达量也明显低于相应的癌旁正常组织。将鉴定的7种miRNA进一步在大鼠C6 胶质细胞瘤模型上进行验证，发现其中5种miRNA在成瘤大鼠血清中的含量明显低于未成瘤鼠，且在成瘤早期即有降低趋势，证实这些miRNA对胶质细胞瘤具有潜在的早期诊断价值。随后对miR-497进行了功能和机制探讨。生物信息学分析显示癌基因IGF-1-R是miR-497的潜在靶基因。Luciferase实验证实miR-497可通过与IGF-1-R的3'-UTR结合调控IGF-1-R的表达。胶质母细胞瘤细胞株U251中过表达miR-497可以抑制IGF-1-R蛋白表达。进一步体外功能实验结果发现，U251细胞中过表达miR-497，细胞的增殖能力随着时间的推移而受到

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