EGFP鼠来源的脂源性干细胞移植治疗DMD模型鼠后新生神经肌肉接头结构和功能的研究

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common genetic muscle disease with characteristic of progressive degeneration and necrosis in skeletal muscle. Afflicted individuals often loss of the ability to walk independently by 12 years and die in their twenties,usually die from respiratory and cardiac failure. Based on our pre-experiment, we observed that the morphology of neuromuscular junctions (NMJs) in mdx mice after stem cell transplantation were obviously improved, and even there were some normal morphology NMJs observed. While, it is still not sure that those NMJs were improved by the stem cells from donors or the self-repaired by receptors? Does those normal morphology NMJs have normal structures and functions? And what mechanism lies in those NMJs regenerated? In order to solve those basic questions, in this study, we use EGFP mice derived ADSCs to tracing the stem cells distribution in the receptor mdx mice. We will apply electron microscope and electrophysiological examination to detect the structure and function changes of those NMJs. We also will detect the MuSK-LRP4-Agrin signaling pathway try to analyze the potential mechanisms lies on those regenerated NMJs, which will help us a better understand of the regenerative mechanism of stem cells transplantation therapy and also enrich regenerative medicine study.

DMD是一种进行性肌萎缩、腓肠肌假性肥大的致死性X连锁隐性遗传病。基因和细胞治疗是治疗DMD最有前景的两种方法。但目前大部分研究都只注重于肌肉改善情况，忽视了作为控制骨骼肌运动的神经肌肉接头(NMJ)的改变情况。在前期的预实验中，我们发现在干细胞移植治疗的mdx鼠肌肉中存在着新生的NMJ。但尚不知这些新生NMJ是来自外源性再生还是自身组织修复?这些新生NMJ否具有控制肌肉运动的功能？机体是通过何种机制促使这些NMJ的再生？为了回答这些基本问题，本研究拟（1）应用EGFP小鼠细胞的示踪作用观察干细胞在体内的分布；（2）通过检测这些新生NMJ突触前膜和突触后膜上的生化成分和电镜下超微结构，与正常的NMJ比较；（3）检测这些NMJ的电生理活动和递质释放情况，来观察其活动功能；(4)通过检测MuSK-LRP4-Agrin信号通路，来分析NMJ在体内的再生机制,这对于我们丰富再生医学理论有重要意义。

本研究采用脂源性干细胞治疗mdx小鼠观察到移植治疗后mdx小鼠运动功能和肌肉病理的改善，观察到骨骼肌中血管数目增加、神经肌肉接头结构恢复相对完整以及肌细胞膜上抗肌萎缩蛋白表达增加。通过利用这一良好的DMD动物治疗模型，旨在建立一套优化的激光显微切割联合单细胞PCR技术鉴定治疗后肌细胞中外源性成份的分析流程，以期为在后续的临床DMD患者干细胞治疗后的疗效评估提供强有力的证据支持和评估手段。在本研究中，使用激光显微切割系统快速、准确地从肌肉组织冰冻切片中获取单个细胞。再利用多置换扩增技术（MDA）的单细胞全基因组扩增方法，均成功扩增了小鼠单个肌细胞的全基因组，并且检出了外源性来源的正常位点。然后我们用优化后的方法对干细胞治疗后DMD患者的肌肉组织进行单细胞的分离和测序，检测是否有正常的外源性肌肉细胞DNA的存在。通过计算样本测序结果中致病突变位点/正常位点的比率，推算出样本中含有正常的肌肉细胞的比例，其含量为3.1%~21.3%之间。但由于在MDA中容易发生等位基因脱扣(allele dropout, ADO)，是导致单碱基突变漏报的关键诱因。为了避免ADO对结果的影响，我们建立了另外一套外源性DNA成份的分析方法。根据我们的DMD的患者受体是男性，骨髓捐献着者供体也是男性，可以根据检测X染色体上致病位点附近100bp的SNP信息，挑选出供体特异性的49个SNP位点，建立样本和捐献骨髓细胞的不同单体型。再检测这些位点样本中的频率，以此来推断肌肉活检的细胞中供体占的比重推算出其余样本均含有供体来源的基因，占比为9.4%~21.3%，均值为18.0%。

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