基于氧化铁纳米颗粒的多模态分子影像用于CRISPR/Cas9的可视化递送及前列腺癌的靶向基因编辑治疗

Gene therapy using CRISPR/Cas9 system is a novel and non-invasive way treatment for prostate cancer. In the reported literature, the growth of prostate cancer cells is closely related to the androgen receptor signaling pathway. The applicant has confirmed that CRISPR/Cas9 system can specifically knock out prostatic androgen receptor with the lentivirus vector, and further inhibit the growth of prostate cancer cells by promoting cell apoptosis. However, the therapeutic effect of CRISPR/Cas9 gene-editing system in vivo is still a basic scientific issue for gene therapy. To solve the potential carcinogenesis and mutagenesis of viral vector, this project will fabricate a non-viral delivery system of CRISPR/Cas9 based magnetic iron oxide nanoprobes, and further visually monitor and evaluate the tumors therapeutic effect of CRISPR/Cas9 system through multimodality molecular imaging. This project is expected to achieve the breakthrough of efficient gene treatment in cancer, has important scientific significance and clinical application value.

CRISPR/Cas9基因编辑系统的癌症治疗是一种新兴的无创性基因治疗方法。研究表明前列腺癌细胞生成过程与雄激素受体表达密切相关。项目申请人前期研究工作证实慢病毒载体递送的CRISPR/Cas9系统能够靶向剪切前列腺雄激素受体，并通过促进细胞凋亡来有效抑制前列腺癌细胞生长。然而，CRISPR/Cas9系统的在体癌症基因编辑疗效仍是基因治疗的基本科学问题。本项目拟以磁性氧化铁纳米探针作为载体构建CRISPR/Cas9的可视化递送系统，以解决病毒载体致癌、致突变的潜在风险；并通过多模态分子影像可视化监控CRISPR/Cas9系统的在体前列腺癌靶向基因编辑疗效。本项目有望为癌症的高效治疗带来突破，具有重要的科研意义和临床应用价值。

CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术，已广泛应用于肿瘤治疗研究。然而，如何将该系统递送至细胞或活体组织仍是一个关键挑战。本项目团队在前期研究工作中以慢病毒载体递送靶向EphA2基因的CRISPR/Cas9系统，获得良好的基因剪辑效率，并验证了EphA2基因作为激素非依赖型前列腺癌治疗靶点的可行性。在此基础上，本项目团队进一步构建出以磷酸钙为核心、负载CRISPR/Cas9系统（核糖核蛋白复合物，RNP）的非病毒纳米载体（RNP@Ca-TAT），靶向EphA2基因以治疗激素非依赖型前列腺癌。因磷酸钙广泛存在于自然界和脊椎动物的骨骼和牙齿中，具有良好的生物相容性；采用HIV-1转录肽的反式激活剂(TAT肽)修饰阳离子钙（Ca-TAT），以提高细胞核靶向性和内吞作用，稳定阳离子钙，避免钙聚集。该纳米载体表征分析显示电镜下平均粒径约190-230nm，分散性好，呈球状形貌；负载率高（RNP负载率约74%）；圆二色谱仪检测表明该纳米载体所负载的Cas9蛋白结构未被破坏，以保证后续功能的发挥；动态光散射仪显示该纳米载体具有良好的稳定性及pH响应特性，可增强其在肿瘤细胞内的溶酶体逃逸能力，以实现RNP进入细胞核进行基因编辑。离体细胞实验显示该纳米载体生物相容性高，具有良好的细胞内吞能力；激光共聚焦显微镜动态监测显示该纳米载体成功实现溶酶体逃逸，并与细胞核共定位；蛋白免疫印迹法显示该纳米载体所负载的CRISPR/Cas9系统能够有效剪辑激素非依赖型前列腺癌细胞（PC3）EphA2基因，并使EphA2蛋白表达量下调48%。细胞功能学实验显示该纳米载体所负载的CRISPR/Cas9系统可显著抑制PC3细胞迁移能力。活体动物实验已成功构建出胫骨旁激素非依赖型前列腺癌模型，经磁共振成像（MRI）初步显示，该纳米载体可在一定程度上抑制肿瘤组织对骨的局部侵袭。总之，本项目团队提出了一种有效递送CRISPR/Cas9系统用于激素非依赖型前列腺癌基因治疗的新策略，为临床治疗激素非依赖型前列腺癌提供有效、无毒副作用的新型治疗方法，具有潜在的临床应用价值。

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