印记基因Xist及H19对猪体细胞核移植重编程的影响及修复研究

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31601187
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    20.0万
  • 负责人：
    李小平
  • 依托单位：
    中国科学院广州生物医药与健康研究院
  • 学科分类：
    C1203.早期胚胎发育及细胞谱系建立
  • 结题年份：
    2019
  • 批准年份：
    2016
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2017-01-01 至2019-12-31

项目摘要

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology plays an irreplaceable role in the research of embryonic development, cells epigenetic reprogramming and transgenic animals. However, there are many problems need to be solved, especially the low efficiency. Previous study on the cloned mice revealed that many imprinted genes abnormally expressed and seriously affected the development of cloned embryos. Gene targeting of Xist and H19 gene greatly improved the efficiency of cloning mice. Our preliminary study on the cloned pigs also found that Xist and H19 gene were abnormally high expressed, but the expression of IGF2 associated with the embryo development was significantly reduced. So in this project, we are aimed to study the genomic imprinting during reprogramming of porcine SCNT. Firstly the expression of Xist, H19 and related genes will be detected in SCNT embryos with various developmental stages. Using the most advanced Next-generation- sequencing technology, the analysis of gene expression profiling and genome-wide methylation of the SCNT embryos will be performed to study the effects of imprinted genes on porcine SCNT reprogramming. On this basis, the most high-fidelity eSpCas9 or SpCas9-HF1 will be applied to target porcine endogenous Xist and H19 gene in somatic cells, attempt to repair the abnormal genetic imprinting, and improve the efficiency of porcine SCNT.
体细胞核移植技术在胚胎发育、体细胞表观遗传学重编程及转基因动物研究中具有不可替代的作用，但其效率低的问题一直未得到解决。前期对克隆小鼠的研究发现克隆胚胎中许多印记基因异常表达，严重影响克隆胚胎的发育。利用基因打靶技术，靶向修饰Xist和H19基因极大的提高了克隆小鼠的效率。我们在前期克隆猪的研究中发现猪克隆胚胎Xist和H19基因异常高表达而与发育相关的IGF2表达显著下调。因此本项目拟利用体细胞核移植获得早期不同发育阶段的胚胎，首先检测Xist和H19及其相关基因在各阶段的表达差异；继而利用目前最先进的二代测序技术深入分析猪克隆胚胎的基因表达谱及全基因组甲基化水平，着重研究印记基因对猪体细胞重编编程的影响；在以上基础上利用目前最新的高保真eSpCas9或SpCas9-HF1在体细胞水平靶向修饰猪内源Xist和H19基因，尝试修复核移植重编程引起的印记异常，以提高体细胞核移植效率。

结项摘要

通过体细胞核移植（SCNT）技术获得转基因猪不仅在农业育种而且在生物医药领域中均具有重要作用,然而过低的克隆效率严重影响了基因修饰克隆猪的应用。本研究中我们首次系统地比较了克隆胚胎和受精胚胎植入前后的转录组差别。我们发现，克隆异常的胚胎出现全染色体水平的基因下调，包括X染色体和每条常染色体。许多基因，如负责调控X染色体沉默的基因XIST，在猪异常克隆胚胎中显著地高表达。利用TALEN技术，敲除供体细胞中XIST，可以拯救每条染色体上原本失活或者下调的基因，从而显著提高猪克隆胚胎的发育潜力。我们进一步发现，XIST敲除的胚胎，其发育潜力的提高与全染色体水平的组蛋白H3K9me3的下调相关。通过向猪克隆胚胎注射H3K9me3的特异去甲基化酶Kdm4A可以显著地降低整体H3K9me3的水平。但是，Kdm4A的注射同时诱导了XIST的异常高表达，原因在于体细胞中XIST启动子区是H3K9me3高度富集的。注射Kdm4A从而降低了克隆胚胎的发育潜能。将Kdm4A注射后的胚胎移植到代孕母体，并未提高猪克隆效率。将XIST基因敲除的胚胎移植到代孕母体，相对于对照组胚胎，克隆效率提高了约6.9倍。本项目利用基因靶向修饰技术修复体细胞核移植胚胎基因印记异常、提高猪克隆效率的研究提供了可靠的理论依据。

项目成果

期刊论文数量（3）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Cre-dependent Cas9-expressing pigs enable efficient in vivo genome editing.
Cre 依赖性 Cas9 表达猪能够实现高效的体内基因组编辑。
  • DOI：
    10.1101/gr.222521.117
  • 发表时间：
    2017-12
  • 期刊：
    Genome research
  • 影响因子：
    7
  • 作者：
    Wang K;Jin Q;Ruan D;Yang Y;Liu Q;Wu H;Zhou Z;Ouyang Z;Liu Z;Zhao Y;Zhao B;Zhang Q;Peng J;Lai C;Fan N;Liang Y;Lan T;Li N;Wang X;Wang X;Fan Y;Doevendans PA;Sluijter JPG;Liu P;Li X;Lai L
  • 通讯作者：
    Lai L
One-Step Biallelic and Scarless Correction of a β-Thalassemia Mutation in Patient-Specific iPSCs without Drug Selection.
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  • DOI：
    10.1016/j.omtn.2016.11.010
  • 发表时间：
    2017-03-17
  • 期刊：
    Molecular therapy. Nucleic acids
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Liu Y;Yang Y;Kang X;Lin B;Yu Q;Song B;Gao G;Chen Y;Sun X;Li X;Bu L;Fan Y
  • 通讯作者：
    Fan Y
XIST Derepression in Active X Chromosome Hinders Pig Somatic Cell Nuclear Transfer.
活性 X 染色体中的 XIST 去抑制阻碍猪体细胞核移植
  • DOI：
    10.1016/j.stemcr.2017.12.015
  • 发表时间：
    2018-02-13
  • 期刊：
    Stem cell reports
  • 影响因子：
    5.9
  • 作者：
    Ruan D;Peng J;Wang X;Ouyang Z;Zou Q;Yang Y;Chen F;Ge W;Wu H;Liu Z;Zhao Y;Zhao B;Zhang Q;Lai C;Fan N;Zhou Z;Liu Q;Li N;Jin Q;Shi H;Xie J;Song H;Yang X;Chen J;Wang K;Li X;Lai L
  • 通讯作者：
    Lai L

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  • 作者：
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    李小平
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    2013
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  • 作者：
    夏圣;李小平;韩慕天;程璐;张苗苗;邵启祥
  • 通讯作者：
    邵启祥

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条件性肌萎缩侧索硬化症（ALS）基因修饰猪模型的建立
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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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