条件性肌萎缩侧索硬化症（ALS）基因修饰猪模型的建立

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset progressive neurodegenerative disease. Due to the unclear pathogenesis, there is still no effective treatment for ALS. Transgenic mouse model was commonly used to study ALS. Unfortunately those mouse models give rise to disease too fast, and the physiological and biochemical characteristic quit difference from human disease, which highly restricted the research of ALS using the mouse model. In 2014 and 2015, we generated SOD1 and TDP-43 two kinds of transgenic pig ALS disease models. Those pig models have more similar disease phenotype with human, especially the characteristics of nerve cell apoptosis, which have not detected in mouse ALS models. However, due to random transgenic engineering we used to generate the pig models, the time of onset and phenotype of disease are various, which can’t be broadly used to study ALS. In this project, we intend to generate motor neuron specific and inducible expression of SOD1 and TDP-43 ALS transgenic pig models by applying porcine ROSA26-targetd genetic modification and latest tetracycline induced system Tet-On3G system. The success of this project will provide more ideal large animal models for ALS study. And with the drug inducible system, we want to study the biological mechanisms of ALS caused by SOD1 and TDP-43 gene mutation, and the possibility of improvement or treatment of ALS disease though targeted-terminating the expression of pathogenic genes, which will implicate the gene therapy of neurodegenerative diseases.

肌萎缩侧索硬化(ALS) 俗称“渐冻人症”是一种慢性运动神经元退行性疾病，由于其发病机制尚不明确，目前仍无有效的治疗方案。常用的ALS小鼠模型其发病快、疾病生理生化特征与人差异较大。本实验室于2014年先后制备了hSOD1和hTDP-43两种转基因ALS疾病猪模型，其疾病表型与人更为相似，尤其是神经细胞的凋亡特征。但由于利用随机转基因技术制备，模型的发病时间和疾病表型存在很大的差异性，限制了其在ALS疾病相关研究中的应用。本项目拟利用新型的猪ROSA26位点特异性基因定点整合系统，结合最新的四环素诱导系统Tet-On3G，建立运动神经元特异性诱导共表达hSOD1和hTDP-43的ALS疾病转基因猪模型，一方面研究SOD1和TDP-43基因引起ALS疾病的生物学机制；另一方面，利用药物诱导系统研究靶向终止致病基因从而改善或者治疗ALS的可行性，为基因治疗神经退行性疾病提供参考依据。

本研究致力于在猪上引入Tet-on系统建立稳定的药物诱导调控基因表达猪模型，利用双位点定点基因敲入策略构建条件性诱导表达SOD1(G93A)和TDP-43(M337V)基因修饰猪模型，以解决传统随机转基因技术造成的基因修饰动物模型表型差异的不可控性。本研究结合基因定点修饰技术，Tet-on系统以及phiC31位点特异性重组酶系统，通过CRISPR/Cpf1介导对已在猪基因组中鉴定出的安全位点Rosa26以及开放位点Hipp11分别定点敲入Tet-on系统rtTA元件，TRE3G启动子及旁侧包括phiC31重组酶特异性识别位点attP的外源目的基因，将以此方法筛选获得的阳性细胞作为供核细胞进行体细胞核移植，首先建立Dox诱导外源红色荧光报告基因表达猪模型,分别在猪胎儿成纤维及耳朵成纤维细胞，核移植克隆胚胎和猪体内进行Dox诱导红色荧光报告基因表达实验，结果表明双位点定点敲入Tet-on系统可以在猪上实现Dox调控目的基因稳定表达。此外，本研究在Dox诱导外源红色荧光报告基因表达猪模型的基础之上，筛选获得ROSA26位点敲入Tet-on3G, Hipp11位点插入TRE3G-SOD1(G93A)-T2A-TDP43(M337V)的猪胎儿成纤维细胞系，通过体细胞核移植技术成功获得Dox诱导性表达SOD1(G93A)和TDP-43(M337V)的ALS基因修饰猪模型。本研究建立的条件性表达外源基因转基因猪体系，不仅为干细胞基因治疗、药物开发及干细胞发育研究提供更加精确、可控的药物诱导转基因大动物平台，解决毒性基因和胚胎致死性基因在大动物中的研究。在此基础上建立的条件性诱导表达SOD1(G93A)和TDP-43(M337V)基因修饰猪模型，为研究致病蛋白在机体内的含量与疾病表型相关性及通过靶向终止致病基因表达从而改善或者治疗神经退行性疾病提供新的大动物模型。

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