毛细管电泳-质谱联用技术用于糖链结构与功能分析

研究一种新的无鞘流毛细管电泳-质谱联用系统，用于糖链结构的分析。采用电泳电路回路和纳流电喷雾电路各自独立的设计，以便于同时优化分离条件和质谱离子化条件；纳流电喷雾头的导电材料为实验室研制的石墨或碳纳米管参杂的导电sol-gel涂层；实验结果表明，通过化学键合方式固定在石英毛细管喷针头上的导电sol-gel涂层能够使用1000小时以上。新的接口设计采用半透膜的方式消除非挥发性电泳缓冲液对质谱离子化的影响，以便于能够最大限度地发挥电泳的分离效能。将毛细管电泳-质谱联用技术分离技术用于糖链结构分析。此外， 还开展微量的糖链的富集技术、衍生方法，以及糖链异构体分离的方法，序列分析， 特定糖链在细胞表面表达水平的定量测定等。这些方法能够用于发现新的肿瘤标志物以及治疗性蛋白药物（抗体或疫苗）的质量控制。

毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）技术正逐步在药物、食品、蛋白质组学、糖组学和代谢组学等领域得到应用。然而CE-MS联用仍然受困于两个关键问题：1）CE-MS接口稳定性和灵敏度的问题；2）CE的分离缓冲液体系难以与质谱兼容。目前，有三种类型的接口：鞘流、液连接和无鞘流接口。无鞘流接口不存在稀释效应，可以获得非常高的检测灵敏度，最适合作为CE-MS联用的接口。然而无鞘流接口的主要问题是使用寿命有限，这将是本项目重点解决的问题。 .我们将碳纳米管-溶胶凝胶复合材料（CNTSCM）作为导电涂层制备了一种新型石英毛细管电喷雾质谱电极。CNTSCM可以通过硅羟基共价键合在石英毛细管表面，大大增强了导电材料在喷雾电极表面的稳定性，从而提高喷雾电极的使用寿命，可以连续使用180 h。我们还研制了一种持久耐用的金箔包裹电喷雾质谱电极用于无鞘流接口成功实现了CE-ESI-MS联用。以生物碱类化合物为分离对象，系统研究了各种因素对CE分离和质谱检测的影响。在优化的分离条件，生物碱的迁移时间在天内（n=5）及天间（n=3）的重复性其RSD值分别小于0.8%和2.7%，五批接口的柱间重复性RSD值在3%左右。对以上分子的检测限达到amol级。对普拉克索及其相关化合物的快速分离和质谱鉴定（MS/MS），对所测物质的检测限达到fmol级。将我们发展的CE-MS应用于蛋白糖基化翻译后修饰的研究中。以糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）为模型建立了CE-MS分离分析糖基化蛋白糖链结构的方法，我们成功地鉴定出RNase B中的糖肽，确定了糖肽中单糖的种类及连接次序，甘露糖组成个数约为5-9个，糖基化位点是34位天冬氨酸。我们发现降低有机添加剂比例和提高盐浓度可以改善糖链的分离度。我们提出一种新的全面分析依诺肝素LMWHs精细结构的策略：即用超高效体积排阻色谱/飞行时间质谱（UPSEC/Q-TOF-MS）对完整的糖链结构进行从上而下的轮廓分析，另一方面用毛细管区带电泳对构成糖链的模块进行自下而上的的定量分析。通过UPSEC/Q-TOF-MS鉴定出依诺肝素钠中具有1,6-成环结构、非还原端为饱和糖醛酸，以及糖链数为奇数的6类70多种寡糖链结构。

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