基于亲合色谱和质谱分析的蛋白-蛋白相互作用识别方法研究

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号:
    21775158
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    65.0万
  • 负责人:
  • 依托单位:
  • 学科分类:
    B0401.分离与分析
  • 结题年份:
    2021
  • 批准年份:
    2017
  • 项目状态:
    已结题
  • 起止时间:
    2018-01-01 至2021-12-31

项目摘要

In the proposed project, we plan to develop new affinity chromatographic techniques for quickly identifying protein-protein interactions in the proteome scale. We propose a “plug and play” strategy for immobilization of the “bait protein” in the monolith to capture the protein complexes in the cell lysate. The “bait protein” can be immobilized in the monolithic bed in the format of metal chelate. The purified proteins can be identified with the mass spectrometry-based proteomic technique. In order to accelerate the protein-protein interaction recognition process, we will try the tryptic digestion of the cell lysate to replace the intact proteins for identifying the protien-protein interactions. The resulting peptides will captured on the affinity column, these strongly retained peptides can be identified by mass spectrometry giving the represented proteins. In combination with bioinformatics, biochemistry and molecular biology, the protein-protein interaction network can be unraveled. The project will provide a powerful technique which can be used for discovering new protein-protein interactions, which may be relevant to the key biologic and clinic pathway. Once we find such key protein-protein interactions, screening of small molecule inhibitor of protein—protein interaction will be performed.
本项目拟开展新的快速检测蛋白-蛋白相互作用的亲和色谱技术,用于蛋白组规模的蛋白-蛋白相互作用的研究。发展一类亲和整体柱技术的制备方法, 即采用“即插即用”式的蛋白质固定化策略,将“诱饵”蛋白以金属螯合的方式固定在整体柱上,从人类细胞裂解液中富集纯化蛋白-蛋白复合物, 然后用基于质谱的蛋白组学技术进行鉴定。为了加快蛋白-蛋白相互作用的识别过程,用酶解肽段替代完整的蛋白质进行蛋白-蛋白相互作用的识别, 即预先将细胞裂解液进行胰蛋白酶解,然后用亲和色谱分离测定强结合的肽段, 通过质谱鉴定肽段序列,确定蛋白。结合生物信息学,生化和分子生物学技术对得到的蛋白-蛋白相互作用进行验证。这项目将为发现具有重要生物学和医学意义的蛋白-蛋白相互作用提供强有力的技术。 一旦发现这样的蛋白-蛋白相互作用,我们就可以开展蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的筛选。

结项摘要

很多重要的细胞过程中,蛋白质都是通过形成复合物行使各种功能,因此蛋白-蛋白质相互作用 (PPI) 在生命过程中起着至关重要的作用。破译PPI是了解蛋白质功能和发现新的治疗靶点的基础。虽然,免疫共沉淀 (co-IP) 和酵母双杂交是分析PPI的标准方法,但是这些技术无法在蛋白组层面实现高通量的分析。近10年来,亲和纯化结合质谱 (AP-MS) 逐渐成为在蛋白质组规模上无偏差鉴定PPI的有力工具,但是常用的串联亲和纯化(TAP)技术需要很复杂的分子生物学实验,而且无法检测瞬态和动态PPI,此外,活细胞中标记蛋白的过度表达可能导致蛋白质错误折叠和聚集,从而改变细胞微环境。因此,高通量研究PPI依然是一件具有挑战性的工作。 .在本项目中,我们发展了研究PPI的新的亲和纯化方法,结合非标定量蛋白组学分析实现高通量并且准确的PPI鉴定方法,用于研究细胞自噬和凋亡过程中一些未知的作用机理。我们在20 µL塑料移液管尖端采用光引发共聚制备了Spin-tip 微型的固定化金属亲和色谱柱 (m-IMAC)。带有His6-标签的蛋白可以方便地通过Ni- NTA螯合作用固定在亲和柱上,然后用细胞裂解液通过色谱柱,被亲和色谱柱富集的细胞中的相互作用蛋白可以用含有咪唑的缓冲液通过离心机轻松快速地洗脱,然后用质谱分析鉴定。我们应用这一方法研究了哺乳动物自噬体转运的自噬接头蛋白FYCO1的 GOLD 结构域的未知功能。鉴定了 96 个 FYCO1 GOLD 结构域结合蛋白,包括先前报道的两种 FYCO1 结合蛋白 CCZ1 和 MON1A。 FYCO1 GOLD 和 CCZ1 之间的特异性相互作用通过免疫共沉淀试验进一步验证。我们进一步发展了一种毛细管亲和色谱柱(cm-IMAC)结合质谱分析用于蛋白组层面无差异的蛋白-蛋白相互作用的分析方法用于细胞凋亡过程相关的PPI。从2396 种蛋白质中以高可信度区分67 个 Bcl-XL 相互作用蛋白,包括已知的 Bcl-XL 相互作用蛋白、BID、BAK1、BCL2L11。我们用免疫共沉淀的方法对共表达的结果进行了验证,证明Bcl-XL可以与HEK293T 细胞中的 LYN 发生相互作用。.我们还将这一技术用于研究小分子药物与蛋白的相互作用。

项目成果

期刊论文数量(9)
专著数量(0)
科研奖励数量(2)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Detection of 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) Dihydrochloride in Polyvinylpyrrolidone by Capillary Electrophoresis with Field-Amplified Sample Injection
采用场放大进样毛细管电泳法检测聚乙烯吡咯烷酮中的 2,2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐
  • DOI:
    10.1007/s10337-019-03765-2
  • 发表时间:
    2019-07
  • 期刊:
    Chromatographia
  • 影响因子:
    1.7
  • 作者:
    Lou Chunli;Zheng Mengmeng;Xu Yao;Shen Yuting;Kang Jingwu
  • 通讯作者:
    Kang Jingwu
Separation of Twelve Posaconazole Related Stereoisomers by Multiple Heart-cutting Chiral-chiral Two-Dimensional Liquid Chromatography
多重中心切割手性-手性二维液相色谱分离十二种泊沙康唑相关立体异构体
  • DOI:
    10.1016/j.chroma.2019.460845
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
    Journal of Chromatography A
  • 影响因子:
    4.1
  • 作者:
    Feng Xu;Yao Xu;Guizheng Liu;Meng Zhang;Shangshang Qiang;Jingwu Kang
  • 通讯作者:
    Jingwu Kang
A Gold Foil Covered Fused Silica Capillary Tip as a Sheathless Interface for Coupling Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry
金箔覆盖的熔融石英毛细管尖端作为毛细管电泳-质谱联用的无鞘接口
  • DOI:
    10.1016/j.chroma.2020.461215
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
    J Chromatogr A
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    Zhang Hanzhi;Lou Chunli;Li Jing;Kang Jingwu
  • 通讯作者:
    Kang Jingwu
Screening of Inhibitors against Histone Demethylation Jumonji Domain-containing Protein 3 by Capillary Electrophoresis
毛细管电泳筛选含Jumonji结构域蛋白3的组蛋白去甲基化抑制剂
  • DOI:
    10.1016/j.chroma.2019.460625
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
    Journal of Chromatography A
  • 影响因子:
    4.1
  • 作者:
    Yi Zhang;Chunli Lou;Yao Xu;Jing Li;Shanshan Qian;Feng Li;Jingwu Kang
  • 通讯作者:
    Jingwu Kang
Profiling Protein Interactions with Label-Free Quantification Proteomics in Combination with Affinity Purification by micro- Affinity Column
结合微亲和柱的亲和纯化,利用无标记定量蛋白质组学分析蛋白质相互作用
  • DOI:
    10.1021/acs.analchem.9b05355
  • 发表时间:
    2020
  • 期刊:
    Anal. Chem.
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    Guizhen Liu;Tao Fu;Han Ying;Shichen Hu;Xuepei Zhang;Mengmeng Zheng;Hao Piliang;Lifeng Pan;Jingwu Kang
  • 通讯作者:
    Jingwu Kang

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其他文献

毛细管电泳分离盐酸美西律对映体的机理研究
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体积排阻色谱法测定低分子量肝素抗凝血因子Xa的活性
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  • 通讯作者:
    康经武

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康经武的其他基金

Polycomb和Trithorax蛋白复合体转录调控机制的蛋白组学及小分子调节剂筛选方法研究
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相似国自然基金

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AI项目解读示例

课题项目:调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要:

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题,其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子,其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而,TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用,影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法,探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用,为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义,并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路:

科学问题:TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达?
前期研究:已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应,但其具体机制尚不明确。
研究创新点:本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线:包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术:TRIM2与病毒RNA的相互作用分析,IFN-β启动子活性检测。
实验模型:使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
      
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