硒蛋白S对溶酶体稳态的调控机制及其在鸡缺硒性脑损伤中的作用

Dietary selenium (Se) deficiency can induce brain injuries accompany with the decreased expression of selenoprotein S (SelS) and the disbalance of lysosomal homeostasis. However, SelS regulating lysosomal homeostasis and its role in brain injury induced by Se deficiency have not been reported.In this study, we will establish the models of Se deficiency chicken brain injuries, SelS silencing and over-expression nerve cells, and then detect the proteome, transcriptome, brain morphology, lysosomes stability (including pH, proton leak, and the distribution of acridine orange) and the related-genes (including sphingosine, cathepsin, Bad, and HSP70), protease activity (including calpain, cathepsin B and D), calcium homeostasis, SelS and its target proteins, procedural necrosis related-genes (TNF, RIP1, RIP3, MLKL, and FADD), and signal pathways of SelS regulating lysosomes exploring the proteomics, transcriptome, real time quantitative PCR, co-immunoprecipitation, laser confocal and western blot technology. This study will identify signaling pathways of the regulation of SelS in lysosome homeostasis and investigate the mechanisms of those pathways in the chicken brain injuries induced by Se deficiency. The results of this study will provide a theoretical basis to the prevention of brain injury due to Se deficiency and a reference for comparative medicine.

日粮硒缺乏能够导致鸡脑组织损伤，同时伴有硒蛋白S(SelS)表达下降和溶酶体稳态失衡，二者与脑组织损伤密切相关，但SelS调控溶酶体稳态的机制及其在缺硒性脑损伤中的作用还未见报道。本课题在建立鸡缺硒性脑损伤及硒蛋白S敲低和过表达神经细胞模型的基础上，应用组学技术、实时定量PCR、免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫印迹等技术，通过对蛋白组、转录组、脑组织形态学，溶酶体稳态（pH、质子漏、吖啶橙分布等）及相关基因（鞘鞍醇、Cathepsin、Bad、HSP70等）、蛋白酶活性（钙蛋白酶、组织蛋白酶B、D等）、钙稳态、SelS及其靶蛋白、程序性坏死基因（TNF、RIP1、RIP3、MLKL、FADD等），以及SelS调控溶酶体稳态的信号通路进行检测，阐明SelS调控溶酶体稳态的信号转导通路及其在鸡缺硒性脑损伤中的作用机制，为防治缺硒性脑病提供理论依据，为比较医学提供借鉴。

内质网定位硒蛋白硒蛋白S（SELS），在保护脑损伤中发挥重要作用，高表达SELS可减轻内质网应激和炎症损伤来缓解脑损伤，SELS表达抑制会加重脑损伤。溶酶体在维持细胞稳态中发挥关键作用，许多退行性神经疾病都存在溶酶体功能紊乱。然而溶酶体稳态失衡是否参与缺硒性脑损伤，SELS是否调控溶酶体功能及稳态尚不清楚。课题组研究发现缺硒可引起小脑组织和鸡胚脑神经元内质网应激、氧化应激、溶酶体稳定性和SELS表达降低，并抑制自噬流，最终导致细胞凋亡。基于此，提出缺硒通过降低SELS表达调控溶酶体稳态失衡引起小脑细胞凋亡的科学假设。本研究在建立SELS敲低鸡胚脑神经元模型及氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、CTSB抑制剂E-64及CTSD抑制剂Pepstatin A处理SELS敲低鸡胚脑神经元模型基础上，对内质网应激相关指标、抗氧化水平、溶酶体相关指标及自噬相关指标、凋亡相关指标等进行检测，结果表明：1）敲低SELS可干扰脑神经元内质网定位硒蛋白的表达，同时升高GRP78、IRE1、XBP1、PERK、ATF4和ATF6的表达水平，引起内质网应激。2）敲低SELS降低脑神经元抗氧化酶活性，自由基及脂质过氧化产物含量增加，引起氧化应激。3）SELS敲低抑制脑神经元溶酶体V-ATPase、CTSB及CTSD蛋白表达，MCOLN1和胞浆中CTSB及CTSD蛋白表达水平升高，NAC可有效缓解SELS敲低引起的溶酶体变化，表明SELS表达降低通过氧化应激引起溶酶体稳态失衡。4）NAC有效恢复溶酶体稳态的同时缓解SELS敲低引起的LC3-2和P62蛋白表达升高，表明SELS表达降低通过溶酶体功能障碍抑制自噬流。5）SELS敲低抑制脑神经元BCL2表达水平，增加BAX、CAS9及CAS3表达，导致细胞凋亡增多，NAC、E-64及Pepstatin A能缓解SELS敲低引起的细胞凋亡，表明SELS表达降低通过自噬流抑制、CTSB和CTSD泄露，引起细胞线粒体途径凋亡。本研究表明SELS表达降低可引起神经元内质网应激，促进ROS积累，导致氧化应激，引起溶酶体稳态失衡，引发自噬流抑制，最终导致细胞凋亡，表明SELS调控溶酶体稳态诱导鸡缺硒性小脑神经元凋亡，这一结果丰富了缺硒性小脑损伤的分子机制，为进一步研究提供参考。

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