II 型cGMP依赖性蛋白激酶的分泌及其细胞外作用靶点

The existing research data show that Type II cGMP dependent protein kinase (PKG II) has no signal peptide and is an intracellular-located serine/threonine protein kinase. The previous study of this project found that PKG II was located on endoplasmic reticulum(ER) and Golgi apparatus, and existed in serum of human and mouse. It could cause phosphorylation of the extracellular domain of epidermal growth factor receptor (EGFR) and block the EGF-initiated activation of EGFR. This indicated that PKG II could be a secreted protein kinase. On this basis, this project will study molecular mechanism of PKG II secretion, especially the role of myristoylation modulation and amino acid sequence of N-terminal of PKG II in guiding PKG II peptide chain to enter “ER-Golgi apparatus” secretion pathway. In the meantime, the project will take VEGFR, PDGFR and c-Met, the members of receptor tyrosine kinases (RTKs) family, as objects to investigate whether PKG II can phosphorylate the extracellular domains of these RTKs and block their activation, exploring the extracellular targets of secreted PKG II. The research of this project will elucidate a new protein secretion pathway and can help to open up a new research field of protein kinases.

现有资料显示II型cGMP依赖性蛋白激酶（PKG II）不含信号肽，是分布于细胞内的蛋白激酶。本项目前期研究发现，PKG II定位于细胞的内质网和高尔基体，存在于人及小鼠血清中，能使EGFR胞外段磷酸化，阻断EGF对EGFR的激活，提示PKG II可能是一个分泌性蛋白激酶。在此基础上，本项目将研究PKG II分泌的分子机制，特别是其氮端豆蔻酰修饰和氨基酸序列在引导PKG II肽链进入“内质网-高尔基体”分泌途径中的作用；以与EGFR同属受体酪氨酸激酶（RTK）家族的VEGFR、PDGFR和c-Met为对象， 研究PKG II 是否通过使这些RTKs胞外段发生磷酸化而抑制它们的激活，进一步探讨PKG II的胞外靶点。研究将阐明一条新的蛋白质分泌途径，并有助于开辟蛋白激酶研究的新领域。

细胞外蛋白质的磷酸化是机体蛋白质磷酸化修饰的重要组成部分，具有重要的生物学意义。分泌性蛋白激酶是这一修饰的执行者，是一新兴的研究领域。本项目在发现II型cGMP依赖性蛋白激酶G（PKG II）是一种新的分泌性蛋白激酶的基础上，对PKG II的分泌机制进行了系统、深入的研究，对分泌性PKG II的细胞外作用靶点进行了初步的探索。.（1）PKG II分泌机制方面，免疫共沉淀、激光共聚焦显微镜和ELISA等检测结果表明，PKG II是通过常规的蛋白质分泌途径（Conventional protein secretion pathway）分泌的，尽管它没有经该途径分泌所需的信号肽。位点突变和构建剪接体的实验结果证实，PKG II的分泌依赖于它的氨基酸链第二位甘氨酸2（G2）的豆蔻酰修饰和其后的第3-30位氨基酸序列。豆蔻酰化的G2和第3-30位氨基酸共同起了“信号肽”的作用，诱导新合成的PKG II氨基酸链进入内质网，通过常规蛋白质分泌途径分泌。.（2）分泌性PKG II胞外作用靶点方面，Western blotting、免疫共沉淀等实验结果证明：在细胞水平，重组PKG II（模拟分泌性PKG II）能与胃癌细胞受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases, RTKs）家族的主要成员EGFR、VEGFR2、PDGFRβ和c-MET结合，使它们发生丝/苏氨酸磷酸化，进而抑制相应的生长因子（EGF、VEGF、PDGF、HGF等）对这些RTKs和它们下游的关键信号转导分子ERK、Akt等的激活；在分子水平，重组PKG II蛋白能与重组各RTKs胞外段蛋白结合，并引起它们丝氨酸/苏氨酸磷酸化。蛋白激酶磷酸化位点预测和位点突变结果显示，EGFR氨基酸链的406位苏氨酸是重组PKG II 使EGFR发生磷酸化并阻断其激活的特异性作用位点；其他RTKs的PKG II 特异的磷酸化位点也已预测出，正在检测中。另外，在裸鼠移植瘤模型，实验结果显示重组PKG II能抑制胃癌细胞移植瘤的生长；在细胞增殖实验，结果显示重组PKG II能抑制胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌细胞株的增殖。.本项目的研究阐明了PKG II 的分泌机制，揭示了一种新的蛋白质分泌模式；研究还证实了重组PKG II对RTKs的激活和肿瘤细胞增殖的抑制，初步探明了分泌性PKG II的胞外作用靶点。

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