抗体识别肿瘤MUC1糖肽的分子免疫学机制研究

Abnormally O-glycosylated mucins are highly expressed in lung cancer, with MUC1 as the most abundant one. They inhibit the apoptosis of tumor cells and the cytotoxity function of immune cells, thus serve as ideal candidates for therapy targets. We published a bioinformatics approach to predict glycopeptide sequences, synthesize such sequences and to generate monoclonal antibodies which bind to such predicted epitopes. For all the five O-glycosylation sites of Tn-modified MUC1 tandem repeat (TR) sequence, site-specific monoclonal antibodies have been generated.In order to characterize the antibody specificity at precise molecular level, and to discover MUC1 glycopeptide epitopes for cancer diagnosis and therapy, we will 1) chemically synthesize the PDTR，PGSTA，GVTSAbackbone, modify them with Tn，STn，STglycans, and study their binding specificity and affinity to antibodies; 2) engineer MUC1-expressing tumor cells by gene transfection and gene knockdown, to generate tumor cell lines which specifically express Tn, STn, or ST glycans, and study the antibody recognition and lysosomal internalization by such cell lines; 3) study the binding to clinical tumor tissue sections by antibodies and establish novel pathological classification of tumor according to glycopeptide epitopes; 4) study the expression of MUC1 glycopeptide epitopes by serum exosome from cancer patients; 5) study the treatment efficacy of antibody-drug conjugate and CAR NK cell therapy targeting MUC1 glycopeptides.

异常O-糖基化的粘蛋白在肿瘤高度表达，以MUC1 量为最高，因其抑制肿瘤细胞凋亡和抑制免疫杀伤细胞，是肿瘤治疗的靶点。申请人发表了生物信息学预测糖肽序列的理论，得到了特异性识别依靠理论预测到的糖肽的单克隆抗体。为了探索这些抗体识别MUC1糖肽的精确分子结构，本项目将 1）在分子水平分别合成PDTR，PGSTA，GVTSA三个抗原表位区的多肽骨架，以三种肿瘤糖链Tn，STn，ST加以修饰，检测抗体的特异性和亲和力；2）在细胞水平，对表达MUC1糖蛋白的肿瘤细胞，用基因转染和基因敲除方法改造糖基转移酶基因，获得特异表达Tn，STn或ST糖链结构的肿瘤细胞系，检测一系列细胞系对抗体的结合和内吞； 3）在临床标本水平研究抗体对肺癌组织和血清外泌体的识别；在模式动物模型水平进行抗体药物偶联物和CAR NK 细胞治疗肿瘤的成药性研究。

异常O-糖基化的粘蛋白在肿瘤高度表达，以MUC1量为最高，因其抑制肿瘤细胞凋亡和抑制免疫杀伤细胞，是肿瘤治疗的靶点。本项目的研究内容是：1，单克隆抗体识别MUC1糖肽分子的研究，我们研究了针对PDTR，PGSTA，GVTSA三个区域的含Tn的MUC1 糖肽序列的单克隆抗体的特异性和亲和力。2，单克隆抗体识别表达MUC1糖肽的不同糖基化的细胞系的研究，我们通过转基因和基因敲除的方法构建表达三种主要肿瘤异常糖链的表达MUC1的细胞系。我们检测了单克隆抗体对各种细胞系的结合，测定抗体对细胞系的亲和力，测定各细胞系对单克隆抗体的内吞能力，并进行抗体药物偶联物对各细胞系的体外杀伤IC50浓度检测。3，单克隆抗体在临床标本水平识别肿瘤的研究，我们用免疫组化方法研究抗体对肺癌细胞的识别，得到抗体表位在肺癌病人的表达数据。4，单克隆抗体在血清标本水平识别肿瘤外泌体糖蛋白的研究，用ELISA方法检测抗体对肺癌病人血清外泌体糖蛋白的识别，并筛选2到3个抗体进行肺癌外泌体早期血清学诊断的特异性和灵敏度研究。 5，在模式动物水平，进行了抗体药物偶联物和CAR T细胞治疗肿瘤的成药性研究，用人肺癌裸鼠模型检测了对肿瘤的特异杀伤能力。本项目的研究结果包括：1，获得和研究了针对MUC1肿瘤糖蛋白3个最小线性抗原模体的抗体。2，合作研发了含有73个糖肽结构的，基于单个分子MUC1肿瘤糖蛋白3个最小线性抗原模体的糖肽芯片，为基于线性表位的肿瘤糖蛋白芯片的研发提出了合理的设计思路。3，发现16A抗体特异识别非小细胞肺癌外泌体，建立了用16A抗体富集非小细胞肺癌病人血清外泌体的方法。4，合作研发了偶联MMAE，Dxd毒素的16A-抗体偶联药物，发现多种肿瘤细胞系对16A高效内吞，介导有效杀伤。完成了ADC治疗肿瘤的疗效和毒理研究。本项目的科学意义是：提出了基于单个糖蛋白分子的最小线性抗原表位模体进行糖肽芯片设计的理论，发现了糖链影响抗原介导抗体偶联药物的内吞。进一步分析糖链对多肽抗原理化性质的影响，将助力糖肽疫苗和治疗性抗体的设计。

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