经人胚胎视网膜前体细胞与视网膜母细胞瘤干细胞差异基因靶向调控细胞增殖安全性

High-flux Transcriptome Analysis is performed to find the different epigenetic changes between human embryonic retinal progenitor cells(hERPC) and human retinoblastoma stem cells(hRSC)， and to reveal the critical genes or signal pathways modulating cell proliferation and tumorigenicity.Then target regulation of hERPC proliferate-tumorigenesis balance is carried out by transcription activator-like effectors nucleases(TALENs)and cytokines.After measuring cell morphology,cell cycle and monoplast clone formation, the hERPCs will be transplanted into the vitreous cavity and subcutaneouly of NOD/SCID immune deficiency mice, and also into the vitreous cavity of rhesus monkeys to eveluate the reproduction and safety of xenografted hERPC with higher proliferate activity and lower tumorigenicity.This study will provide the both new insight into different gene regulation between hERPC and hRSC,and new therapy of clinical stem cell replacement of inreversible blindness such as glaucoma and retinoblastoma.

本课题采用高通量转录组测序进行不同胚龄人胚胎视网膜前体细胞（hERPC）和人视网膜母细胞瘤干细胞(hRSC）全基因比对分析，筛选调控RPC增殖、致瘤命运的关键基因和信号通路，通过转录激活效应因子核酸酶（TALENs）联合关键基因、细胞因子精确靶向调控RPC的增殖-致瘤平衡机制，以期获取高自我再生能力、低致瘤性、分化性能好的RPC种子细胞，行体外细胞形态、细胞周期、单细胞克隆形成检测，同时进行NOD/SCID免疫缺陷鼠和非人灵长类恒河猴体内注射观察其走向和命运，存活增殖能力和致畸、致瘤性。通过以上研究，本课题既有望为干细胞替代治疗临床应用的种子细胞缺乏和安全性两个基本问题提供重要解决依据和方案，也可为视网膜母细胞瘤的治疗提供基因预警和基因治疗的新靶点。

干细胞替代治疗不可逆神经致盲性眼病在过去数十年取得了长足进展，但其临床应用仍存在难以解决的问题，本项目致力于解决其中两个关键问题，即种子细胞来源有效和安全性问题，以期获取高效分化、低成瘤性的种子细胞。本项目成功在体外筛选、扩增培养了人胚胎视网膜前体细胞、视网膜母细胞瘤细胞和视网膜母细胞瘤肿瘤干细胞，利用新型二代高通量转录组测序分析明确了调控细胞分化、增殖、致瘤的关键基因和信号通路，并优化了基因转染体系，筛选出适用于视网膜母细胞瘤的基因转染体系。基于以上基础，通过相关信号通路和转染关键基因调控有效实现了细胞“分化-增殖-致瘤”的平衡调控，可在体外高效诱导视网膜母细胞瘤细胞分化为感光细胞样细胞和视网膜神经节细胞样细胞，将分化细胞分别移植入裸鼠、视网膜色素变性和色素性青光眼小鼠眼内，发现分化细胞成瘤性显著降低，可在眼内存活并整合入宿主视网膜，对宿主视功能无损害。此外，本项目进一步开展了恒河猴大动物研究，构建恒河猴高眼压视神经损伤模型和类老年黄斑变性模型，能较好地模拟人类青光眼及老年黄斑变性的病变过程，可为后续细胞体内移植观察提供优良的动物模型平台。本课题为安全、有效的干细胞临床替代治疗奠定了基础，也为视网膜母细胞瘤分化治疗提供了线索。

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