单宁酸靶向抑制血小板表面蛋白二硫键异构酶抗血栓的作用及机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81900140
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
尤涛
依托单位：
苏州大学
学科分类：
H0805.出血、凝血、纤溶与血栓
结题年份：
2022
批准年份：
2019
项目状态：
已结题
起止时间：
2020-01-01 至2022-12-31

项目参与者：
--
关键词：
蛋白二硫键异构酶血栓血小板活化单宁酸

项目摘要

Protein disulfide isomerase (PDI) plays a key role in the activation of platelets and coagulation cascade, thereby constituting a novel antithrombotic target. However, most small molecular inhibitors of PDI may penetrate the cell membrane and disrupt cytoplasmic PDI function and protein synthesis, therefore limiting their application in the long-term prophylaxis or treatment for thrombotic diseases. Tannic acid (TA) is a polyphenol compound with a relatively larger molecular size and higher polarity, which renders it a membrane impermeable agent. My preliminary study showed that TA binds PDI and inhibited PDI activity. Treatment with TA inhibited platelet activation and arterial thrombus formation in mice. This project is aimed to determine the role of TA as a novel antithrombotic agent by the targeted inhibition of platelet surface PDI. Using in vivo thrombosis model and molecular biology techniques, I will investigate the binding mode between TA and PDI, elaborate the inhibition of PDI-mediated platelet and coagulation factor activation by TA, and study the prevention of thrombosis by TA in vivo. Results from this study will expand the knowledge of PDI as an antithrombotic target and shed new light on the management of thrombotic diseases.

蛋白二硫键异构酶PDI是调控血小板活化、凝血通路激活的关键胞外分子，正成为新的抗血栓治疗靶点。然而，多数小分子PDI抑制剂易通过细胞膜、干扰细胞内PDI功能和蛋白合成，使其在血栓性疾病的长期预防或维持治疗中应用受限。作为一种天然多酚，单宁酸分子量和极性较大，很难通过细胞膜进入细胞内部。申请人通过前期研究发现，单宁酸与PDI结合并抑制其活性，具有抗血小板活化和抗动脉血栓形成的作用。本项目围绕TA通过靶向抑制血小板表面PDI发挥抗血栓作用这一核心问题，综合运用活体血栓模型和分子生物学技术，解析单宁酸结合并抑制PDI的分子机制和作用特征，阐明单宁酸对PDI介导的血小板活化和凝血因子激活的影响，研究单宁酸对血栓的预防治疗作用。通过本项目的实施，将深化人们对靶向抑制PDI治疗作为新型抗血栓治疗模式的理解，为血栓性疾病的防治提供新的实验依据。

结项摘要

蛋白二硫键异构酶PDI是调控血小板活化、凝血通路激活的关键胞外分子，正成为新的抗血栓治疗靶点。我们通过分子对接，从具有心血管保护作用的植物多酚中筛选PDI抑制剂，发现单宁酸（Tannic acid，TA）与PDI的底物结合口袋及活性中心的结合分值较高。蛋白包被芯片的表面等离子共振（Surface plasmon resonance，SPR）检测显示，液相的TA与固定相的重组PDI蛋白在体外流动系统中高亲和力结合，结合常数Ka为5942（mol/L）/s，kD小于1.68×10-9mol/L，显示两者不可逆结合。体外di-E-GSSG 荧光分析法检测 PDI 活性，显示随着TA浓度上升，对体外PDI活性抑制作用逐渐增强。胰岛素底物荧光切割实验结果也验证了上述发现。同时，TA 对PDI 家族分子ERP57和ERP72的还原酶活性也存在一定的抑制作用。用MPB 在体外标记血小板表面的巯基，加入刺激剂诱导活化，免疫印迹法检测显示TA能够抑制整合素αIIbβ3 表面自由巯基的形成。流式细胞分析显示TA抑制血小板表面整合素αIIbβ3构象开放与PDI结合的。Alamar Blue和Annexin-V检测显示TA对血小板活性和凋亡无不良影响。透光法检测显示，TA 对不同刺激剂诱导的血小板聚集具有抑制作用。流式检测显示 TA 抑制血小板表面整合素活化、颗粒释放。细胞骨架染色显示 TA抑制血小板在纤维蛋白原表面的铺展，体外模拟血流剪切力作用下，TA减少了血小板在胶原表面的粘附，并且抑制血块收缩。小鼠经TA给药后，不影响检测出血时间，但能够抑制损伤诱导的动脉血栓形成，通过 intravital 荧光显微镜显示血栓形成速度、体积均有显著下降。研究结果提示TA能够抑制PDI活性，发挥抗血栓作用并不增加出血风险，有望为抗血栓治疗提供新的依据。