细菌双杂交体系的超高灵敏流式分析及其在蛋白质相互作用研究中的应用

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    21105082
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    25.0万
  • 负责人：
    吴丽娜
  • 依托单位：
    厦门大学
  • 学科分类：
    B0404.化学与生物传感
  • 结题年份：
    2014
  • 批准年份：
    2011
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2012-01-01 至2014-12-31

项目摘要

本项目拟通过超高灵敏流式检测技术与细菌双杂交系统的有机结合，发展灵敏、快速、高分辨、高通量的蛋白－蛋白相互作用研究新方法。研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础，作为酵母双杂交的衍生系统，细菌双杂交系统在蛋白－蛋白相互作用的鉴定和分析中具有实验周期短、操作简单、转化率高、假阳性率低、蛋白不需要核定位等优点。单个细菌水平的蛋白－蛋白相互作用研究有助于更准确地考察蛋白在活细胞中的相互作用状况，揭示传统生物化学检测手段中因集权平均而被掩盖的个体差异。研究工作将在实验室自行研制的多通道超高灵敏流式检测仪的基础上开展，建立单个细菌水平蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的定量检测方法，通过对双杂交系统报告细菌的快速、逐一分析，实现蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的单细菌水平定量表征和统计分析，揭示它们之间的定量关系。本项目对于蛋白质功能的准确解析、信号转导通路的确定、及新的药物靶点的发现具有重要意义。

结项摘要

本研究通过超高灵敏流式检测技术与细菌双杂交系统的有机结合，借助双色免疫荧光染色法，实现蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的单细菌水平定量表征和统计分析，发展了灵敏、快速、高分辨、高通量的蛋白－蛋白相互作用研究新方法。取得的重要进展如下：.1）构建了新的带标签细菌双杂交体系。采用常规的蓝白斑筛选及比色定量法，验证了细菌双杂交体系的成功构建，确定了在相互作用蛋白上融合表达标签蛋白不会影响蛋白的相互作用。.2）建立了单个细菌水平低拷贝β-gal表达的超高灵敏流式检测方法。利用超高灵敏流式结合荧光底物C12FDG实现了单细菌水平β-半乳糖苷酶本底表达的检测，并结合MUG法定量出单个细胞中大约21个拷贝的β-半乳糖苷酶本底表达量(Biosens Bioelectron. 2013, 48, 49-55)。.3）在单细菌水平低拷贝β-gal表达的超高灵敏流式检测方法建立的基础上，进一步优化了针对细菌双杂交体系的C12FDG染色条件，成功实现了单细菌水平细菌双杂交体系蛋白相互作用的超高灵敏流式检测。.4）建立了单个细菌水平相互作用蛋白表达量分析的超高灵敏流式检测方法。利用免疫荧光法对融合表达的标签蛋白进行标记，通过超高灵敏流式检测仪获得细菌相互作用蛋白表达量的分布情况。同时建立了基于免疫荧光染色的单细菌水平β-半乳糖苷酶检测方法。.5）建立系统、完善的蛋白－蛋白相互作用研究方法。利用免疫荧光染色结合超高灵敏流式检测，对细菌双杂交系统进行了相互作用报告基因与蛋白表达的双参数检测，以BTH101 pUT18-Flag-Pal/pKT25-His-TolB为模型，选择不同的诱导时间点，考察并确定了Pal和TolB的蛋白表达量和相互作用报告因子的表达量成正相关。.6）增加了利用双荧光同时测定相互作用蛋白表达与相互作用强度之间的定量关系的研究内容。将该方法应用于对一系列相互作用强度已知的蛋白对进行单细菌水平的蛋白表达定量分析，以期得到细菌双杂交系统中蛋白相互作用强度与报告基因表达量之间的内在联系，建立一种快速检测蛋白相互作用强度的新方法。.7）此外，结合噬菌体对宿主菌的特异识别和双砷染料－四半胱氨酸体系，利用噬菌体只能在活菌中繁殖，通过对重组噬菌体四半胱氨酸的检测实现死菌和活菌的区分，创建了痕量细菌的灵敏、特异及存活状态的快速检测方法(Anal. Chem. 2014, 86, 907−912)

项目成果

期刊论文数量（3）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（5）
专利数量（0）
High-throughput single-cell analysis of low copy number beta-galactosidase by a laboratory-built high-sensitivity flow cytometer
使用实验室建造的高灵敏度流式细胞仪对低拷贝数 β-半乳糖苷酶进行高通量单细胞分析
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    2013
  • 期刊：
    Biosensors and Bioelectronics
  • 影响因子：
    12.6
  • 作者：
    Yang, Lingling;Huang, Tianxun;Zhu, Shaobin;Zhou, Yingxing;Jiang, Yunbin;Wang, Shuo;Chen, Yuqing;Wu, Lina;Yan, Xiaomei
  • 通讯作者：
    Yan, Xiaomei

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    吴丽娜
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  • 发表时间：
    2012
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  • 作者：
    吴丽娜;黄领梅;沈冰
  • 通讯作者：
    沈冰

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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