杀稻瘟菌素类肽核苷关键生物合成步骤和新颖抗性机制的酶学研究

Blasticidin S, a 4'-aminoacyl-4'-deoxyhexose cytosine produced by Streptomyces griseochromogenes, was the first antibiotic used in large scale in replace of mercurial to fight against rice blast due to its good fungicidal activity as well as the harmlessness to fishes. Blasticidin S and its resistance gene bsd have been increasingly used as the selection marker in the transgenic studies.BS features a unique C2=C3 double bond of the pyranoside ring that implies two dehydrations; the leucyl acylation of the beta-amino group of arginine, but finally hydrolysed during the maturation of BS was reported as a novel self-resistance;In addition, the common biosynthetic steps for the 4'-aminoacyl-4'-adeoxyhexose, such as the oxidation of 4-hydroxyl group of the cytosylglucuronic acid(CGA) into 4-keto-CGA and fowllowed by amination of the keto group into 4-amino-CGA, were also proposed but in need of experimental proof to support. Based on the overall comparative analysis of the previous biosysnthetic studies on the blasticidin S,mildomycin,arginomycin and gougerotin, we revised and proposed a complete pathway for BS biosynthesis. This project will study above mentioned questions in vivo and in vitro,and aims to provide the insights into the biosynthesis of this type of nucleoside.

杀稻瘟菌素S(BS)是由链霉菌产生的4'-氨酰基-4'-脱氧己糖胞嘧啶，由于其良好的生物活性和对鱼类无害，成为第一例大规模用于防治水稻稻瘟病的汞取代抗生素。BS和它的抗性基因现在被广泛应用于真核细胞转基因的筛选。BS结构中蕴含了一个独特的酶学反应：己糖C2-C3位两次脱水形成烯键；BS生物合成过程中还包含了一个新颖的抗性机制：BS亮氨酸酰化及其成熟；此外，4'-氨酰基-4'-脱氧己糖胞嘧啶生物合成中的共性问题：胞嘧啶葡萄糖醛酸C4位羟基成酮再转氨过程，都没有实验数据支持。本项目在综合比较分析杀稻瘟菌素，米多霉素，精霉素和古氏菌素四个结构类似物生物合成的研究成果基础上，重新推导了杀稻瘟菌素的生物合成途径，拟通过体外反应和体内敲除来阐明以上科学问题，为提升对这一类抗生素生物合成的了解提供实验证据。

杀稻瘟菌素对霉菌和酵母有良好的抑制活性，防治水稻稻瘟病的效果优于有机汞农药，并对鱼类无毒，在日本很快被广泛地替代有机汞农药来防治稻瘟病，目前广泛地应用于真核细胞转基因筛选研究中。杀稻瘟菌素原始产生菌无法进行遗传操作，限制了对其合成途径的研究，其中包含一些新颖的生化反应。本项目研究内容如下：1）克隆和表征了催化杀稻瘟菌素成熟的氨肽酶PepN1-N3，它们的编码基因均位于BS合成基因簇之外，并且PepN1是最主要的水解酶。2）SAM依赖型的甲基转移酶BlsL必须在DBS被亮氨酰化之后才能进行胍基基团的甲基化。3）脱甲基杀稻瘟菌素DBS精氨酸侧链上beta位的氨基会被亮氨酰化，这步反应由3Fe-4S蛋白BlsK催化，BlsK可以从基础合成代谢中将亮氨酰化的tRNA‘劫持’，它的铁硫簇起到稳定蛋白结构的作用，是其催化活性所必需的（未发表）。4）杀稻瘟菌素的类似物米多霉素包含一个羟甲基化胞嘧啶（hmCMP），它是由MilA催化CMP羟甲基化后再掺入到最终结构当中的，我们解析了其晶体结构，解释了其不识别dCMP的底物特异性分子机制。此外，本项目一直致力于SAM自由基酶BlsE的功能研究，试图阐明六元糖环3‘，4’位两次脱水的机理，还发现了一个cytosine形成的新途径，这些工作预计在今后两年完成并发表。 BlsK，BlsL和PepN催化了杀稻瘟菌素合成的最后三步，我们的结果阐明了这三步的反应顺序并确定每步反应所对应的酶，其中BlsK和PepN催化了亮氨酸的加载和去除，这一步看似无效的反应中间存在一步甲基化反应，说明它们的反应顺序是严格控制的。CMP水解酶的同工酶和CMP羟甲基化酶MilA的研究暗示我们CMP到底是流向次级代谢合成还是参与基础DNA代谢，而生成的游离cytosine会不会构成细菌中新的信号分子，后续我们将继续开展相关工作。

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