我国鼠疫耶尔森氏菌东方型菌株基因组多态性及微进化的研究

目前国际鼠疫研究者普遍认为，第三次世界鼠疫大流行起源于中国，其病原体鼠疫耶尔森氏菌东方型菌株起源于云南。而我们基于SNP分型和大规模基因组测序的结果却不完全支持东方型菌株的云南起源假说。本课题拟选择300株左右的我国东方型鼠疫菌株（主要来自云南、广西和贵州等地），利用SNP分析、MLVA分析、CRISPR分析等技术手段，全面研究其基因组多态性，建立我国东方型鼠疫菌株基因组多态性数据库；解析我国东方型鼠疫菌株的精细群体遗传学结构和基因组微进化路线；并结合菌株的地理信息和流行病学数据，以谱系生物地理学的研究思路，勾勒东方型菌株基因组多态性与鼠疫疫源地扩散之间的联系。通过本课题的研究，预期将可以解答鼠疫菌东方型菌株的起源问题，并探讨东方型菌株在我国（云南省内以及由云南邻近省份）扩散的规律；进而为特定生物型菌株的检测、菌株溯源以及鼠疫疫情控制等工作提供基础性数据。

为确定鼠疫耶尔森氏菌东方型菌株是否起源于云南，我们对鼠疫东方型菌株进行了系统的遗传多态性分析：.(1) 建立了基于多重PCR和多重位点特异引物延伸（Allele Specific Primer Extension, ASPE）的Luminex悬浮芯片进行鼠疫菌东方型菌株SNP分型的方法，可通过一次反应同时检测待测菌株18个SNP位点的碱基状态。.(2) 利用三个Luminex反应（分别一次检测18个、18个和17个SNP位点），建立了鼠疫菌东方型菌株53个SNP的高通量分型方法，分析了193株我国东方型鼠疫菌；基于这53个SNP，193株菌被分为13个基因组型；发现了属于1.ORI2.r群的中国菌株，证实了存在缅甸与中国之间东方型菌株的流动；同时还有1.OR1.a（最古老的的）东方型菌株，进一步明确了第三次鼠疫大流行是由中国起源的。.(3) 我国有一些“特殊”东方型鼠疫菌可能是在实验过程中与质控菌株EV76（源于东方型的疫苗株）误标记。我们测定了我国EV76-CN菌株的全基因组草图序列，并鉴定了12个特异突变位点，对全部12株中国“特殊”东方型菌株和世界其他来源的EV76菌株进行了系统发育分析，发现pyrE基因可能是EV76菌株进化过程中的突变热点；.(4) 为建立更为可靠的VNTR分型技术，我们利用生物信息学技术系统分析了鼠疫菌基因组上的280个位点，并从中确定了88个具有分型意义的VNTR；我们利用97株鼠疫菌作为研究对象，系统测试了这些位点的多态性；以基于SNP的群体遗传结构为基础，我们比较了现有39个VNTR位点及44位点的分型结果，在此基础上建立了“14+12”的MLVA分型体系，分型结果更能反映真实的群体遗传结构；并利用该体系分析了956株鼠疫菌（其中东方型菌株193株）。. 通过本研究，我们建立了高分辨率、高通量的鼠疫菌东方型菌株遗传多态性分析方法（SNP和MLVA），系统了解了我国鼠疫菌东方型菌株的多态性，并明确了东方型鼠疫菌起源于我国这一论点。此外我们推测了源于东方型的EV76疫苗菌株在实验室传代过程中的突变热点pyrE基因，并绘制了EV76系列菌株在全球的扩散过程。这一研究为鼠疫菌的谱系生物地理学研究提供了丰富的数据，也为其他生物性鼠疫菌的相关研究提供了借鉴。

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