猪链球菌新型毒力（相关）蛋白HP0197致病机制的研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
30901076
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
张安定
依托单位：
华中农业大学
学科分类：
C1803.兽医细菌及其他微生物学
结题年份：
2012
批准年份：
2009
项目状态：
已结题
起止时间：
2010-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
徐卓菲；李冉；魏子贡；胡攀；刘成；
关键词：
毒力（相关）蛋白蛋白质组学猪链球菌致病机制基因芯片

项目摘要

猪链球菌是目前危害养猪业的一种重要病原，也是一种重要的人畜共患病病原。新型毒力（相关）因子的发掘和功能研究是猪链球菌致病机制研究的关键之一。前期研究结果表明HP0197蛋白是猪链球菌新的、重要的毒力（相关）因子，但其致病机制并不清楚。本项目拟通过黏附、侵入宿主细胞实验、吞噬实验以及动物实验（检测诱导宿主炎性因子、临床症状、病理变化等）从体内、体外水平解释HP0197基因缺失后细菌致病力减弱的原因。同时通过基因组表达谱芯片和比较蛋白质学方法在转录组和蛋白质组水平上进行突变株和亲本株表达谱的研究，力图阐明HP0197基因缺失后是通过影响哪些基因的表达而导致细菌致病力降低的分子机制。将造成致病力减弱的原因和分子机制结合起来，阐明猪链球菌新毒力（相关）蛋白HP0197的致病机理，为系统地发掘猪链球菌的致病机制奠定基础。

结项摘要

猪链球菌是目前危害养猪业的一种重要病原，也是一种重要的人畜共患病病原。新型毒力（相关）因子的发掘和功能研究是猪链球菌致病机制研究的关键之一。前期研究结果表明HP0197 蛋白是猪链球菌的重要保护性抗原，可能是新的、重要的毒力（相关）因子。本研究通过黏附、侵入宿主细胞实验、吞噬实验以及动物实验（检测诱导宿主炎性因子、临床症状、病理变化等）从体内、体外水平对HP0197 基因缺失菌株的生物学特性进行了系统研究，证实其为细菌新的、重要的毒力相关蛋白，可通过调节荚膜的表达，影响细菌抗吞噬的水平从而影响细菌致病力。为了进一步阐明HP0197基因缺失菌株致病力显著降低的分子机制，同时应用基因组表达谱芯片和比较蛋白质学方法在转录组和蛋白质组水平上进行突变株和亲本株表达谱的研究，发现HP0197基因缺失菌株表达谱与ccpa基因缺失菌株表达谱的相类似，提示表面蛋白HP0197调控荚膜合成很可能是通过调控ccpa实现的。Ccpa是一种重要的碳代谢调节因子，其活性的发挥有赖于HPr的结合。为了探讨这种可能性，我们成功将WT、Δhp0197菌株中的HPr基因引入了FLAG标签，并从WT、Δhp0197纯化出HPr蛋白，通过凝胶迁移（EMSA）实验分析HPr蛋白促进CcpA结合启动子的活性，发现纯化自WT的HPr显著增强了CcpA的活性，而纯化自Δhp0197的HPr则丧失该活性，表明HP0197通过调节HPr来调节CcpA的活性，从而上调表达碳代谢相关基因，并下调表达荚膜合成基因簇等毒力相关基因。HPr的磷酸化受到胞内糖浓度调节，而糖的转运效率主要取决于受体的表达（未发生改变）及膜内外的浓度差。基于此我们提出了一种假设，即表面蛋白HP0197可在细菌表面富集糖，从而增大膜内外浓度差，有利于糖转运。通过将重组蛋白吸附到Ni树脂而沉降的方法，我们确实发现含有HP0197的树脂上清中糖浓度显著降低，有力的证实了该假设。而且我们开展了HP0197晶体结构的分析，发现该蛋白的N’-结构域可结合细胞表面的糖，从而在感染后帮助细菌获得有利的能源。.本研究可得出结论：HP0197结合糖，帮助细菌获得能源，并通过HPr磷酸化，调控CcpA活性，进一步调节荚膜合成基因的表达来调控细菌抗吞噬活性，从而影响细菌致病力的分子机制。培养博士研究生两名，发表SCI研究论文3篇，获国家发明专利1项，获省市优秀论文奖3项。