猪链球菌诱导IL-17及其在致中毒样休克中作用和机制的研究

Infection with Streptococcus suis highly virulent strain could activate inflammasome and further induce the expression of IL-17, which contributed essentially to the development of Streptococcal toxic shock-like syndrome (STSLS). Therefore, the present project would firstly identify the main cell type for IL-17 expression by Flow cytometry analysis, and then identify the signaling for IL-17 induction with blocking antibodies of inflammasome effector cytokines. Besides, the project would further elicit the role of IL-17 on blood-tissues barrier broken and development of STSLS with three animal infectious models (infection with IL-17 blocking antibody; infection with il17 knockout mouse; infection with mouse transplanted with bone marrow of wt or il17 knockout mouse). Correspondingly, the present project would further study the role of IL-17 on the expression of tight junction proteins and the permeability of blood endothelial cell barrier with cell model and serial frozen tissue sections to elicit the mechanism for IL-17 to contribute to blood-tissues barrier broken and tissue invasion by Streptococcus suis. In combination of these studies, the aim of this project was to clarify the mechanism how IL-17 was induced by Streptococcus suis and how IL-17 contributed to blood-tissues barrier broken to facilitate bacterial invasion into different tissues, and finally resulted in high bacterial burden, inflammatory cytokines storm, and multiple organs failure – the characterizations of STSLS. Therefore, the project would contribute to the understanding of development of STSLS, the major concerns about diseases caused by Streptococcus suis.

猪链球菌高毒力菌株感染激活inflammasome并进而诱导IL-17的表达，是其致中毒样休克综合征（STSLS）的重要原因。本项目拟通过流式细胞术分析猪链球菌感染时表达IL-17的主要细胞类型，通过阻断抗体鉴定inflammasome激活IL-17表达的信号分子，解析猪链球菌诱导IL-17表达的主要细胞类型及其信号通路。利用IL-17抗体阻断模型、基因缺失小鼠及其骨髓移植模型，系统解析IL-17在猪链球菌致STSLS中的作用，并同时从细胞模型和冰冻组织病理切片水平上，解析IL-17降解细胞间紧密连接蛋白的机制，揭示IL-17在细菌突破组织脏器屏障及致病中的作用及机制。力图阐明“猪链球菌如何诱导IL-17产生，IL-17又是如何发挥突破血管内皮细胞屏障的效应来帮助病原侵入各种组织器官，导致STSLS的发病机制”。

本项目前期研究发现猪链球菌溶血素（SLY）高水平激活NLRP3 inflammasome是导致炎症因子风暴以及中毒样休克（STSLS）的关键分子机制。IL-17A作为NLRP3的下游效应因子，其在STSLS中的作用和机制并不清楚。.因此，本项目首先通过在非致STSLS菌株中高表达SLY，证实其可通过NLRP3依赖的方式导致STSLS，说明猪链球菌通过变异高表达SLY确实是导致STSLS的重要原因。对NLRP3直接的下游效应因子IL-18和IL-1阻断，和构建il18基因敲除小鼠，发现猪链球菌感染激活NLRP3 inflammasome后进一步通过下游的IL-18来诱导IL-17A产生，最终导致炎症因子风暴和中毒样休克；且IL-17A主要由CD4+ T细胞产生。.本研究进一步构建il17a基因敲除小鼠，发现猪链球菌感染il17a-/-小鼠后的死亡率、临床发病、病理变化没有明显改善。血中炎症因子和组织载菌反而更高。究其原因发现IL-17A的缺失显著降低了血液中性粒细胞和抗菌肽的水平。说明IL-17A介导了免疫细胞的活化和抗菌物质的产生，在早期控制感染中发挥作用，但在猪链球菌导致的炎症因子风暴中并没有发挥主要效应。.由于脑膜炎是猪链球菌感染最主要的临床表现、临床调查表明猪链球菌脑膜炎近几年的发病比例越来越高，鉴于IL-17A在破坏粘膜屏障方面的潜在作用，本研究还分析了IL-17A在猪链球菌脑膜炎中的作用和机制。首先构建了猪链球菌脑膜炎发病模型，发现il17a基因的缺失并不显著影响猪链球菌感染所致的急性死亡和病理损伤；但却显著改善神经症状和后期死亡率。对其机制进行解析，发现IL-17A显著调控了脑组织中ZO-1、Occludin和 Claudin-5等紧密连接蛋白的转录和表达，从而调控着血脑屏障的通透性以及病原菌入脑，在猪链球菌致脑膜炎中发挥重要作用。.因此，本研究按计划解析了猪链球菌中毒样休克诱导的IL-17A主要依赖的信号途径—NLRP3/IL-18，发现IL-18在STSLS中发挥重要作用；IL-17A并不是导致STSLS的关键炎症因子，但在感染早期发挥着诱导中性粒细胞活化等促进病原清除的功能。本研究还首次解析了猪链球菌可通过诱导IL-17A而抑制紧密连接蛋白的转录和表达，从而破坏血脑屏障并导致脑膜炎的机制，并发现IL-17A可作为治疗猪链球菌性脑膜炎的潜在靶标。

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