建立基于大鼠ES和iPS细胞的条件基因打靶平台

Compared with the mouse, rats possesses some physiological features, such as having a larger body size and being more suitable for surgical manipulation, which confer rats advantages in biomedical, nutritional and behavioral modeling research over mouse. The successful derivation of rat ES and iPS cells capable of transmitting through germline is fundamentally important for producing gene-knockout rats. In 2008, Ying and Smith groups reported first authentic rat ES cell lines while two other groups successfully generated rat iPS cells reprogrammed by defined factors. Derivation of germline-competent ES and iPS cells makes it possible to efficiently generate knock-out rats. However there is still a long way to go in creating an efficient platform for rat gene-targeting. 1) To date, rat ES cells are often unstable during cell culture maintenance and tend to obtain abnormal karyotype. 2) Rat gene targeting vector design and basic parameters in cell transfection remain to be optimized. 3) Rat conditional knockout technology needs to be established for more sophisticated research. 4) In addition, rat ES culture technology and blastocyst microinjection technology remain to be optimized for more efficient production of gene knock-out animals. This project is going to establish an efficient rat gene-targeting platform through the use of rat ES and iPS cells, with an emphasis on the conditional knockout technology.

大鼠做为异于小鼠的哺乳动物模型广泛应用于生物医药领域。建立有生殖系遗传能力的大鼠 ES和iPS 细胞是获得大鼠基因敲除模型的关键。2008年，应其龙等两个科研小组首次获得了真正的大鼠ES 细胞。丁盛和肖磊课题组分别利用化学分子和基因重编程技术，构建了大鼠iPS细胞。2010年应其龙组利用大鼠ES细胞进行大鼠基因打靶，得到了p53基因敲除大鼠。这使进一步创建有效的基因敲除大鼠模型成为可能。接下来的主要挑战是：1.现有大鼠ES 细胞系还不稳定，核型易出现异常；2.基因敲除所需工具载体，转染条件等基础参数还没有建立；3.条件性基因敲除系统还没有建立；4.国内除了上述3个方面，还欠缺基础的大鼠ES细胞培养体系及胚胎显微注射技术。本课题计划用大鼠 ES 和iPS细胞，通过基因打靶技术获得特定基因敲除模型 (如癌症、心血管疾病、神经退行性病变、免疫缺陷等)，建立大鼠ES/iPS条件打靶平台。

基于大鼠的一些自身优点，大鼠已经作为模式动物，广泛用于神经学、药物学等其它学科的研究。在这些研究领域中大鼠基因组编辑对于建立大鼠疾病模型起着重要的作用，而这很大程度上依赖于大鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ES）和诱导性多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）的建立。可以稳定传代的大鼠胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的获得为这些研究奠定了基础。目前利用同源重组对这些已有的胚胎干细胞系进行基因打靶已经获得了基因敲除大鼠。随着新的基因打靶技术的出现，利用Zinc Finger Nucleases (ZFNs), TAL effector Nucleases (TALENs) and CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR Associated Protein)技术也成功地获得了基因敲除和条件性基因敲除的大鼠，并且相较于同源重组技术，新技术的基因打靶效率更高。尽管如此，大鼠基因敲除技术中仍然有很多问题存在。首先，大鼠胚胎干细胞的核型不稳定，采用病毒系统诱导得到的大鼠诱导性多能干细胞因有外源基因的整合而存在着未知的隐患；其次，新的基因打靶技术经常产生难以预测的脱靶现象，这会干扰大鼠突变体的遗传分析，而基于大鼠胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的基因打靶技术还不像小鼠中那么成熟，有待进一步优化。我们和美国密苏里大鼠资源与研究中心合作，建立了不同品系的大鼠胚胎干细胞系，挑选了一些可以稳定传代并且核型正常的细胞系用于后续的基因打靶实验。同时，我们也获得了不携带外源基因的大鼠诱导性多能干细胞系，这些细胞系核型正常，可以稳定传代。利用这些细胞系进行基因打靶，我们成功的获得了基因敲除、基因敲入及条件性敲除的大鼠细胞系，并且我们将这些打靶成功的大鼠细胞系进行囊胚注射得到了嵌合体。总之，我们进一步优化了大鼠基因打靶技术，建立了基于大鼠胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的基因打靶平台，为大鼠疾病模型的建立和应用奠定了基础。

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