β2-肾上腺素受体Gs/Gi信号转换障碍在β1-肾上腺素受体自身抗体致心衰中的作用及机制

High titer of β1-adrenoreceptor autoantibody (β1-AA) is reported to distribute in heart failure patients, which induces sustained receptor activation and heart failure, while the mechanism still unclear. In the preliminary study, β1-AA, without combining to β2-AR, induced sustained β1-AR activation could be alleviated by Gi-protein biased agonist of β2-AR. On the basis of that, this study aims to explain that the disorder of signaling switch in β2-AR signaling pathway may cause β1-AR endocytosis inhibition by using overexpress/siRNA methods, TIRFM, etc.; demonstrated that weaken β1/β2 heterodimer is one of the mainly mechanisms for the disorder of signaling switch of β2-AR induced by β1-AA via co-Immunoprecipitation and fusion proteins, etc.; certify that β1-AA alters the conformation of both β1 and β2 adrenoreceptor will influence β1/β2 heterodimerization via FRET and Frozen electron microscopy. Therefore, to confirm the scientific hypothesis: β1-AA could cause the disorder of signaling switch of β2-AR, then result in β1-AR endocytosis inhibition and sustained activation, finally develop into heart failure through changing β1 and β2 adrenoreceptor’s conformation and β1/β2 heterodimerization.

心衰患者体内具有高滴度的β1-肾上腺素受体（β1-AR）自身抗体（β1-AA），可抑制β1-AR内吞，导致受体持续激活及心衰的发生，但机制不清。我们前期原创性发现，β2-AR Gi偏向激动剂可缓解β1-AA对β1-AR的持续激活效应，但β1-AA并不直接结合β2-AR。本研究拟在此基础上利用过表达/siRNA、荧光同步成像全内反射显微镜等手段，阐明β2-AR下游Gs/Gi信号转换障碍可引起β1-AR内吞抑制；利用co-IP、融合蛋白等技术，阐明β1/β2-AR异源二聚化减弱是β1-AA引起β2-AR Gs/Gi信号转换障碍的关键机制；利用冷冻电镜、FRET等技术，阐明受体构象改变是β1-AA影响β1/β2-AR异源二聚化的上游机制。以此证明科学假说：β1-AA通过影响β1/β2-AR构象及二聚化，导致β2-AR Gs/Gi转换障碍，β1-AR内吞抑制，进而引起β1-AR持续激活及心衰。

心力衰竭（简称心衰）是各种心脏疾病的终末阶段，是目前临床上重要的致死病因。β1-肾上腺素受体（β1-AR）自身抗体（β1-AA）存在于近一半心衰患者体内，可通过持续激活β1-AR，导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍。然而，β1-AA持续激活β1-AR的机制尚不完全清楚。本项目（1）首先利用杂交瘤技术获取大量高纯度的鼠源单克隆β1-AA。利用全内反射荧光显微镜、生物发光共振能量转移、乳鼠心肌细胞跳动、表面等离子共振等方法，证实β1-AA可以抑制β2-肾上腺素受体（β2-AR）下游的Gi信号通路，导致G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）活性减弱，β1-AR磷酸化不足，从而难以募集支架蛋白β-arrestin，造成β1-AR内吞障碍，β1-AR下游信号持续存在，最终引起小鼠心脏结构破坏和功能不全；给予β2-AR/Gi偏向激动剂ICI118551治疗可以逆转β1-AA致β1-AR持续活化及心脏损伤的效应。（2）利用免疫荧光共定位、ELISA、TUNNEL等方法发现，心衰患者中存在可激活β2-AR/Gi通路的β2-AR自身抗体（β2-AA），β1-AA与β2-AA的比值与心功能呈负相关；并且β2-AA可在离体水平抑制β1-AA引起的乳鼠心肌细胞过度收缩、凋亡，在体水平改善β1-AA引起的小鼠心功能不全。（3）利用cAMP-GloSensor、流式细胞仪、冷冻电镜等方法，鉴定出心衰患者外周血中存在5种功能亚类的单克隆β1-AA，收集到150份β1-AA阳性的心衰患者外周血单个核细胞群，已获得少量分泌单克隆β1-AA的记忆B细胞；同时已获得了稳定的高纯度的β1-AR蛋白以及β1-AR-Gs复合物的结构解析图，这些均为进一步利用结构生物学方法探究β1-AA引起β1-AR特殊的构象变化，进而从上游探究β1-AA持续激活β1-AR的机制奠定了关键性的基础。

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