PKCδ介导的未折叠蛋白反应与胰岛素抵抗

内质网应激通过启动未折叠蛋白反应导致胰岛素抵抗，在肥胖、糖尿病等的发生发展中具有重要作用。但迄今为止，对未折叠蛋白反应的启动机制缺乏深入了解。申请者发现：内质网应激可增加PKCδ的磷酸化和内质网移位，提高JNK的磷酸化和内质网分子伴侣CHOP的表达；PKCδ特异性抑制肽可抑制内质网应激所致的CHOP mRNA表达的上升；PKCδ的作用与PP2A活性和GRP78去磷酸化密切相关。由此，申请者提出如下假说：内质网应激通过激活PKCδ而增加PP2A的活性，致使GRP78去磷酸化，从而启动未折叠蛋白反应，并最终导致胰岛素抵抗。在本研究中，申请者拟采用各种分子生物学的方法，如蛋白过度表达、基因沉默、免疫沉淀、磷酸酶活性分析等，系统研究PKCδ在未折叠蛋白反应和胰岛素抵抗中的作用；阐明未折叠蛋白反应启动的分子机制。该研究将加深对未折叠蛋白反应启动和胰岛素抵抗发生机制的理论认识。

内质网在分泌蛋白和膜蛋白的折叠、装配、分泌中起着至关重要的作用，内质网功能的紊乱可导致错误折叠或未折叠蛋白的聚集，并由此引发内质网应激。为应对增加的内质网应激，未折叠蛋白反应 （UPR）或内质网应激反应将被启动。未折叠蛋白反应由3个内质网应激感受器肌醇酶1、RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶和激活作用转录因子介导。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是未折叠蛋白反应的主要调节者。在非应激的情况下，GRP78与3个内质网应激感受器结合，并使之处于失活状态。内质网应激导致GRP78与错误折叠蛋白或未折叠蛋白结合，分离GRP78与3个内质网应激感受器的结合，从而激活未折叠蛋白反应。迄今为止，GRP78与内质网应激感受器分离的机制尚不清楚。本课题的目的是探讨参与调控GRP78与内质网应激感受器分离的信号通路，并阐明其在内质网应激诱导的胰岛素抵抗中的作用。db/db 小鼠的脂肪组织和培养的3T3-L1脂肪细胞被用于本研究，培养的3T3-L1脂肪细胞经游离脂肪酸处理诱导内质网应激和胰岛素抵抗，western blot和免疫沉淀被用于检测蛋白表达、蛋白磷酸化、以及蛋白间的相互结合，携带目标蛋白cDNA和shRNA的重组腺病毒被用于过度表达或沉默目标蛋白。结果表明，游离脂肪酸可增强脂肪细胞PKCδ的磷酸化、PP2A的活性、内质网应激感受器的磷酸化、以及CHOP的表达，同时增加GRP78的去磷酸化。敲出PKCδ和PP2Ac α亚基可增加GRP78的磷酸化，并降低内质网应激感受器的磷酸化和CHOP的表达。结果同时发现，敲出PKCδ可降低PP2A活性。此外，游离脂肪酸诱导的脂肪细胞的胰岛素抵抗可被PKCδ和PP2Ac α亚基的基因沉没所逆转。结果表明，①UPR反应在游离脂肪酸诱导的脂肪细胞胰岛素抵抗中具有重要作用；②PKCδ/PP2A/GRP78信号通路参与了游离脂肪酸诱导的UPR反应；③GRP78的去磷酸化是启动UPR反应的关键环节。本研究的结果为阐明UPR反应的启动机制提供了新的理论解释，为胰岛素的抵抗提供了新的可能的靶点。

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