微生物降解壬基酚聚氧乙烯醚的代谢途径及分子机理研究

The hard-degradable, lipophilic, bioaccumulative and estrogen-like characters of Nonylphenol ethoxylates (NPEOs) increase the risk to human health and ecosystems. This project aims to use long chain NPEOs degrading bacterium Pseudomas sp. NPE and short-chain NPEOs degrading bacterium Arthrobacter sp. NP as standard strains to elaborate the pathway and mechanism of the degradation of NPEOs by analyzing the metabolism products and gene functions. The project can be devided into four parts as follows: 1) LC-MS analysis of metabolic intermediates and the end products of NPEOs degradation; 2) Genome and transcriptome sequencing of the two bacteria using the 454 sequencing technology to acquire the degradation genes information; 3) In-vitro expression of the degradation genes and analysis of the function of the corresponding proteins; 4) Based on the above results, elaborating the detailed metabolic pathway and molecular mechanism of microbial degradation of NPEOs. The project can not only fill the gaps of genes resources of the NPEOs degradation, but also enable us to accurately understand the degradation process and mechanism of microbial degradation of NPEOs in the environment. Moreover, the research can help us to assess the pollution level of the NPEOs in the environment, and also can guide the bioremediation of the NPEOs.

壬基酚聚氧乙烯醚的难降解性、亲脂性、生物累积性和类雌激素效应给人类健康和生态系统带来了潜在的巨大风险。本课题拟以前期获得的长链壬基酚聚氧乙烯醚高效降解菌Pseudomas sp. NPE和短链壬基酚聚氧乙烯醚高效降解菌Arthrobacter sp. NP为研究对象，分别从代谢产物和功能基因的角度进行研究：1）采用LC-MS技术分析代谢中间产物以及终产物；2）利用454测序技术对两株菌的全基因组和转录组进行测序，进一步获得降解基因；3）降解基因体外表达后分析各基因编码蛋白的功能；4）结合上述结果勾勒出壬基酚聚氧乙烯醚微生物降解的详细代谢途径和分子机理。研究成果不仅可以填补壬基酚聚氧乙烯醚降解基因资源的空白，同时能够使我们准确地了解壬基酚聚氧乙烯醚在环境中微生物作用下的降解过程和降解机理，有助于更准确地评估目前环境中壬基酚聚氧乙烯醚的污染水平以便对壬基酚聚氧乙烯醚污染土壤和水体进行生物修复。

本研究以前期获得的长链NP9EO高效降解菌Pseudomonas sp. NPE 和短链NP1EO高效降解菌Arthrobacter sp. NP 为研究对象，分别从代谢产物和功能基因的角度对NPEOs的降解进行了研究。.1. 采用HPLC、LC-MS、GC-MS等技术分析代谢中间产物以及终产物，发现Pseudomonas sp. NPE 采用非氧化途径将NP9EO降解生成NP1EO和NP2EO；Arthrobacter sp. NP 可以氧化NP1EO生成NP并释放乙醛，而NP进一步氧化生成氢醌和壬醇。.2. 对两株菌的全基因组和转录组进行测序，以及结合转座子突变技术，进一步获得降解基因的信息。.Pseudomonas sp. NPE在npe基因簇的作用下催化生成短链NPEOs，其中主要功能基因为npeA、npeB、npeC，分别编码NPE变位酯酶、乙醛裂合酶、二醇脱水酶，npeABC的调控蛋白为npeR；npeAB在有氧条件下催化末端羟基位移生成少一个EO的NPEOs的反应目前还未有报道。中间产物乙醛则通过乙醛酸循环氧化， 缺失异柠檬酸裂合酶基因aceA和苹果酸合成酶基因aceB的突变株丧失了降解NP9EO的能力，且细菌活力明显下降。.Arthrobacter sp. NP则在adh基因簇的作用下将NP1EO催化生成NP，其中主要基因为adhA、adhB、adhC、adhD，分别编码醇脱氢酶、TonB-dependent受体蛋白的同系物、醛脱氢酶、二甘醇酸脱氢酶。随后NP在npmA的作用下单加氧生成氢醌和壬醇，降解氢醌的基因簇为hqdRA1A2BCDEF。hqdR为调控蛋白，HqdA1A2共同催化氢醌开环生成4-羟基黏糠酸半醛（HMSA），随后HMSA在hqdCD的作用下生成3-酮己二酸。体外表达hqdE后发现其可以降解邻苯二酚和苯三酚生成顺，顺-己二烯二酸（黏糠酸）和马来酰乙酸，hqdF则可能参与氢醌双加氧酶hqdA1A2的活化，但是hqdE和hqdF的具体功能还有待于进一步验证。.本研究首次概括阐明了NPEOs降解机制，而研究成果不仅填补了NPEOs降解基因资源的空白，而且有助于对工程细菌进行改造以应用于土壤和水体的原位修复。

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