基于定位探针介导剪切的等温指数扩增方法研究

Isothermal exponential amplification of nucleic acids has always been a hotspot of research. Among those, strand displacement amplification (SDA), due to its simple mechanism, fast reaction rate and high amplification efficiency, has been intensively studied in recent years. So far, however, the high dependence of nicking endonuclease on a specific sequence in target molecules has not been well addressed yet, which is now challenging the method’s universality. Moreover, the notable nonspecific amplification is still a serious common problem of SDA and most other isothermal amplification techniques. To address these issues, this project is planning to develop a universal method for nucleic acid cleavage, entitled aligner-mediated cleavage (AMC), in which the nicking endonuclease is able to make a cleavage at any desired site in a precise and controllable manner, without the requirement of any specific sequence in target nucleic acid. On this basis, a novel isothermal exponential amplification method will be established by integrating the basic principle of SDA and AMC, with the expectation to greatly improve the method’s universality. In addition, the introduction of 3’ terminator and nucleotide analogue in primers is supposed to dramatically inhibit the nonspecific amplification, and thus endow the proposed amplification technique with some unique advantages such as low background, high sensitivity and high specificity, which will show great promise in many fields like genetic studies and molecular diagnosis.

核酸等温扩增研究一直备受瞩目，其中链置换扩增（SDA）由于具有原理简单、反应速度快、扩增效率高等优点，近年来获得了广泛的研究。但迄今尚未很好地解决切口酶对于目标核酸分子中特定识别序列的依赖问题，致其通用性面临挑战。此外，严重的非特异性扩增现象仍是困扰SDA乃至目前多数等温扩增方法的共性难题。为此，本项目拟针对性地发展一种定位探针介导剪切技术，使切口酶在定位探针指导下，不依赖于目标核酸分子中的任何特定序列，即可对其任一碱基位点实现精确、可调的剪切。在此基础上，结合SDA的基本原理，发展一种基于定位探针介导剪切的核酸等温指数扩增技术，有望从根本上解决方法的通用性问题，同时拟采用3’端终止剂封闭、核苷酸类似分子嵌入和带脱碱基位点的荧光探针来有效抑制非特异性扩增作用。预计拟发展的核酸等温指数扩增方法将具有低背景、高灵敏度、高特异性等突出优势，这对于基因研究、疾病诊断等许多领域都具有十分重要的价值。

MicroRNAs （miRNAs）是一类短链小分子RNA，是肿瘤等疾病的诊断/预后生物标志物以及治疗的靶标，并在许多生物反应过程（如细胞的发育、增值、分化以及程序性死亡）中扮演重要的角色，对其进行精准检测在疾病诊断、预后评估以及药物研究等许多领域具有重要意义。由于miRNA序列很短，丰度极低而且同一家族的miRNA高度同源，因此对于miRNA的快速精准检测仍面临重大挑战。本研究提出了一种基于定位探针介导的核酸剪切方法，可以实现目标分子的精准可调剪切，同时重点探讨了其在T型DNA分子结构中的剪切性质。在此基础上，发展了一种miRNA高灵敏和通用检测的“识别-剪切-扩增”（ICA，identification-cleavage-amplification）的策略，并成功应用于microRNA-155 （miR-155）和microRNA-21（miR-21）的检测研究。该方法结合了定位探针介导的剪切和链置换等温扩增技术（ATMC-SDA）来实现ICA过程。首先是定位探针侧臂和DNA扩增子3’端与目标miRNA互补，三者形成稳定的T型DNA 结构；然后在定位探针指导下切口酶对DNA扩增子进行剪切，此过程DNA扩增子不断被剪切，响应信号得到一级放大；剪切下来的DNA序列触发SDA反应，响应信号得到二级放大。ATMC-SDA反应过程中响应信号得到级联放大，具有很高灵敏度。其识别过程中，需要DA和DM的识别序列与目标miRNA完全互补才能形成稳定的T型结构，切口酶才能实现剪切，即便是单碱基的错配也会影响剪切和扩增的。ATMC-SDA仅需要变换DA茎部的识别序列就可以灵活改变切口酶；针对不同的miRNA的检测均可以使用相同的引物；更为重要的是其仅需变换DA的侧臂和DM的3’端序列，就可以实现不同的miRNA的检测。研究结果显示，应用ATMC-SDA对于miR-155和miR-21的检出限（LOD）分别为5.6 aM和3.1 aM，在最佳条件下， miRNA-155的线性范围是10.0 aM至10.0 pM。人血清实验进一步表明，ATMC-SDA与复杂的生物样品兼容。因此，本研究发展的ATMC-SDA检测miRNA具有灵敏度高、特异性强、通用性好、适用于复杂生物样品等优点，并且检测过程中不需要逆转录过程，在临床疾病早期诊断、预后评估和药学研究等领域具有相当大的应用潜力。

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