基于双歧杆菌表达系统的EV71 VP1亚单位口服活疫苗研究

2008年手足口病大爆发后，卫生部已将该病纳入法定传染病管理。EV71型病毒是其主要传染源，人是其唯一宿主，且以5岁以下儿童的发病率最高。该病毒主要通过粪便、唾液或呼吸道飞沫等传播，对幼儿园和学校等人群聚集场所的易感者危害最大，但目前尚无治疗EV71的疫苗和特效药。因此，研究新型的EV71疫苗是预防该病发生的当务之急。本项目在NSFC资助项目（30200244, 结题； 30671865，在研）研究成果和已公开的4个发明专利（见工作基础部）的基础上，研制双歧杆菌表达的EV71/VP1亚单位口服活疫苗，并经动物实验，检测该疫苗的免疫原性和免疫保护的效率。与以往研究不同，本研究的特色在于借助大肠杆菌LT毒素B亚单位的天然五环结构和LTB与肠上皮细胞上MG1分子特异结合的特点，将VP1与LTB融合表达，构建集"粘膜免疫佐剂、抗原靶向表达和一苗多价"于一体的口服亚单位活疫苗，为该病的防治提供保障。

近年来全国频发的手足口病(HFMD)无疑是对我国公共卫生安全造成较大的威胁，卫生部已将该病纳入法定传染病管理。EV71型病毒是其主要传染源，人是EV71的唯一宿主且普遍易感，其中以5岁以下儿童的发病率最高。该病毒主要通过粪便、唾液或呼吸道飞沫等传播，幼儿园和学校等人群聚集场所是本病的高发区，对他们的危害最大，但目前尚无治疗EV71的疫苗和特效药，因此，研究新型的EV71疫苗是预防该病发生的当务之急。本项目在NSFC前期资助项目的研究成果的基础上，获得如下新成果：（1） 将EV71的VP1基因克隆到本课题组构建的具有自主知识产权的双歧杆菌表达载体pBEX中，并成功转化到双歧杆菌中，研制出BF表达的EV71/VP1的亚单位口服活疫苗（pBEX/VP1）。（2）经过PCR检测和质粒稳定性试验证明，该转化子即使在无抗生素（选择压力）的正常条件下(37℃)和42℃高温条件下培养传代，在连续50代的传代培养中，质粒的保有率高达98%，十分稳定。（3）动物实验证明，该口服疫苗的免疫原性较强，中和抗体滴度数据表明其具有较强的免疫保护效率。（4）特别是，该项目借助大肠杆菌LT毒素B亚单位的五环状天然结构和LTB与肠上皮细胞上MG1分子特异结合的特点，构建了VP1与LTB融合的表达载体（pBEX/VP1-LTB），该融合蛋白具有集粘膜免疫佐剂和抗原靶向表达的特点。该融合蛋白激发的VP1抗体滴度比用pBEX/VP1单独免疫高2倍。（5）项目组结合细胞因子研究技术发展和实验结果及研究进展，在原有研究内容的基础上额外增加了免疫前后实验小鼠血清中细胞因子变化的研究，为揭示该口服疫苗的分子机制提供另一个侧面的数据。总之，课题组按照申报的计划完成了所有项目的检测和试验，获得了预期的研究结果。

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