HPV16感染中核心早期蛋白的免疫效应机制及宫颈癌的免疫学靶向阻遏

HPV相关的宫颈疾病严重危害着妇女的健康，而HPV逃逸机体免疫攻击得以持续感染是宫颈癌发生的必要条件。HPVE5,E6,E7作为HPV主要致病因子其介导机体产生免疫耐受的机制尚不明了。我们前期研究结果提示：系统靶向HPV致病的多因素研制疫苗有助于将HPV在感染之初,持续感染,术后复发等状态中彻底清除。本项目拟以高危HPV中占主导的HPV16为核心，利用生物信息学平台筛选HPV16 E5,E6,E7蛋白CTL表位多肽；利用AAV携带E5+E6+E7多肽基因持续表达该长肽；利用人源免疫重建SCID小鼠，建立模拟HPV16感染的动物模型；建立持续表达HPV16E5，E6，E7的免疫全能动物肿瘤模型（初步构建成功）；通过短效长肽启动免疫和长效长肽增强免疫等方法探讨最佳的疫苗配伍和免疫方式。探索HPV16E5、E6、E7在感染免疫中可能的作用机制，及"短效长肽+长效长肽"联合防治宫颈癌的可行性。

本项目的实施和完成进一步明确了HPV16 E5，E6，E7在机体抗HPV16感染免疫中的作用机制，完善和补充了HPV免疫防御机理。实验证实HPV16E5从多角度改变了细胞生物学行为，参与HPV感染与致病过程。具体表现在：（1）E5的表达影响了细胞周期正常调控，明显促进细胞恶性增殖，使S期细胞大量停滞，并通过下调P21抑制细胞调亡；（2）E5在细胞膜结构上大量表达，并通过与细胞有丝分裂纺锤体检测点蛋白Bub1的相互作用而导致细胞分裂异常，异型核出现，并以此为切入点与E6、E7形成作用网络，并互为依托促进致病潜能；（3）E5通过与P-paxillin和E-cadherins相互作用以不同机制导致细胞运动异常，侵袭和迁移能力增强。同时，E5可改变细胞正常骨架结构，使恶性细胞体外成瘤能力增强。这些结果更加坚定了我们以E5为靶点制备疫苗的信念。结合2008年Nature提出的“长肽疫苗”概念，我们根据多个生物信息学软件同时靶向HPV16 E5，E6，E7分析针对H2-Db 的抗原表位，结合大量免疫效应实验，成功获得三肽最强组合。为克服普通多肽无法持续表达的问题，我们选用腺相关病毒装载目标片段,建立“重组腺相关病毒+长肽基因”作为“长效长肽”，让它们“强强联合”。结合前期构建的持续表达HPV16E5、E6、E7的细胞模型和免疫全能动物模型，在体内外同时验证疫苗的有效性和安全性。在免疫方式上，我们原创性的提出：先将小鼠随机分为治疗组（先荷瘤再给药）和预防组（先给药再荷瘤），再通过“启动免疫+增强免疫”免疫小鼠。令人惊喜的是，三肽联合作用的预防组小鼠完全无瘤生存且在实验180天后当再次给予相当量的瘤负荷后小鼠仍无瘤生存；治疗组中肿瘤生长速度明显低于对照组，且肿瘤体积明显缩小，小鼠生存时间延长，各组急慢性毒性试验无明显毒副作用。为深入挖掘疫苗作用机制，我们利用免疫细胞因子芯片和流式细胞学方法检测肿瘤微环境中各免疫分子表达情况，以期更好诠释HPV感染和致病的分子免疫学机制。.研究结果表明：生物信息学筛选的三肽片段抗原性好，免疫源性强。用腺相关病毒作为载体可稳定表达目的基因。通过构建HPV16感染相关疾病模型，探讨“短效长肽+长效长肽”疫苗的免疫效应、配伍及免疫方式，将为实现宫颈癌免疫学防治新突破提供可能。部分结果已发表SCI收录国际期刊论文3篇，国内权威期刊论文3篇，获相关奖励2项。

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