利用单分子和荧光方法研究生物大分子的动力学

最近几年发展起来的单分子观察手段和单分子微操纵技术，对于研究生物大分子的相互作用及动力学是必不可少的有力方法。特别是与荧光技术的结合使得从前一些无法直接观察到的现象得以澄清。国际上一些著名的大学和研究机构纷纷开展这方面得研究，取得前所未有的进展。本课题将在我们已经具有的生物大分子研究基础上，利用单分子和荧光技术，开展DNA与蛋白质的相互作用动力学研究。我们将聚焦于DNA与解旋酶和组蛋白这两种具有重要生物学功能的蛋白质之间相互作用动力学问题上，发展单分子荧光共振能量转移技术、快速反应-停流结合荧光光谱技术、隐失波散射技术、磁阱等。将这些技术用于精确定量地测定解旋酶RecQ和PcrA等马达蛋白的动力学参数和工作状态，用于探测不同的DNA序列与组蛋白的结合参数和结合动力学过程，揭示核小体组装的动力学机制。同时紧密结合实验，开展相应的理论分析和计算机模拟研究。

利用原子力显微镜和磁镊研究了抗癌药物顺铂对单个DNA分子结构的影响，发现了DNA的成环和凝聚现象。我们提出一个顺铂导致的DNA变软(softening)-成环(looping)-缩短(shortening)-凝聚(condensing)模型（简写为SLSC模型）来解释观察到的顺铂导致的DNA凝聚过程。我们认为通过远程交联使DNA形成小环结构是铂类抗癌药物（如顺铂、卡铂、奥沙利铂等）作用的重要特征。通过云母表面微液滴的表面张力产生的限域效用，不用任何凝聚剂，我们实现了在体外将DNA束缚成环形结构。通过原子力显微镜成像，我们发现被限域的DNA分子在较大的液滴中可形成随机卷曲型或半有序折叠环。当液滴足够小时，DNA很容易形成紧密有序的面包圈状的环形。在荧光共振能量转移的单分子实验中，我们观察到，连接到石英表面的双链DNA分子受到一个激光场和快速流动液体的双重作用可实现解链。这一方法可应用于在局部空间定点打开双链DNA。布卢姆氏综合征是一种常染色体隐性遗传疾病，具有这种遗传特征的人有明显易患各种癌症的倾向。我们利用各种停流实验研究了布卢姆氏综合征蛋白解旋酶核心解旋DNA的动力学机制。实验结果显示这一解旋酶核心能够以蠕动方式打开双链DNA。我们发现了一种从前不为人所知的RecQ解旋酶相邻单体的相互抑制作用。利用单分子荧光共振能量转移显微术，我们发现在饱和浓度RecQ下，对于长尾DNA, 解旋启动比短尾DNA有更长的时延。反应停流动力学实验也证实了这一现象。我们设计了一种新的程序，能够对DNA 原子力显微镜图像进行处理。不仅可有效减少背景噪音，而且能够从生物大分子图像中高效准确地提取量化信息。我们利用原子力显微镜研究了DNA与抗癌药物顺铂的相互作用。通过定量分析DNA的原子力显微镜图像，显示出随着顺铂浓度的升高，DNA的局部弯角增大，驻留长度减小。研究了顺铂和反铂并用导致的单个DNA分子的弹性响应和长度变化，发现一定浓度的反铂能够提高顺铂凝聚DNA的能力。利用轨迹自动识别方法，研究了单细胞内表皮生长因子受体（EGFR）运输轨迹的模式特征。利用磁镊研究了促旋酶与DNA单分子的相互作用，发现诺氟沙星使促旋酶与DNA 的结合增强。利用量子点追踪，在单细胞中研究了紫杉醇对EGFR内吞运输的影响。通过DNA的单分子操纵，研究了在扭转约束情况下，扭转弹性对DNA凝聚的影响。

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