雌激素促卵泡发育同步化的病理效应与调控信号通路

Our research found that estrogen stimulation of high doses could cause the rapid follicular development of synchronization, and acquired a super-physiological number of oocytes with appropriate developmental potential, but symptoms of ovulation disorder in polycystic ovarian syndromes were accompanied when the animals reach adulthood. This project start from the follicular synchronization and accompanied anovulation induced by estrogen to establish mouse models of medical diseases with evaluation of morphological observation and molecular biological indexes; at the same time, FSH receptor inhibition and Leptin receptor gene defect models were used as reference and to obtain new models with combine factors. Using the cDNA chips and proteomic mass spectrometry, the signal pathway of estrogen regulation, with comprehensive analysis on Leptin and FSH signal pathways, will be defined to obtain relevant pathological mechanisms of medical diseases and to establish new diagnostic technologies by their validation with clinical samples.

本研究组发现，腹腔外源大剂量雌激素刺激导致性成熟前小鼠卵泡发育同步化，能够手工分离获取大量具有继续发育潜能的卵母细胞，但当小鼠成年后经诱导同步化的卵泡呈现排卵障碍等多囊卵巢综合征的症状。本项目从雌激素促卵泡发育同步化而排卵障碍的病理现象着手，借助形态观察和分子生物学检测指标，建立卵泡发育同步化而排卵障碍小鼠模型；同时，参照研究组已建立的大鼠模型，构建小鼠FSH受体免疫抑制模型，并引入Leptin受体缺陷模型，综合分析卵泡发育和排卵障碍的病理表现的基础上，建立新的联合因素动物模型；从雌激素信号途径着手，结合FSH和Leptin信号途径，利用cDNA芯片和蛋白质谱鉴定技术，分析卵泡发育与排卵障碍的调控机制，具有重要的理论意义；在解析有关病理机制的同时，寻找卵泡发育和排卵障碍有关信号途径的关键节点，利用抗体芯片寻找卵泡液和血液中的生物标志物，通过临床样本的验证建立卵泡发育和排卵障碍诊断新技术。

瘦素是由肥胖基因ob编码，脂肪组织分泌的重要的脂肪因子。对应的瘦素受体(leptin receptor, LepR)是由糖尿病基因db编码的产物，在人和动物体内均存在多种亚型，广泛分布于下丘脑、垂体等中枢神经系统和外周性腺组织如卵巢中。文献报导，瘦素与瘦素受体结合后，主要通过长型受体上三个酪氨酸活性位点（Tyr985、Tyr1077、Tyr1138）激活JAK/STAT等一系列信号转导途径，调节下丘脑功能而影响生殖内分泌，其功能异常会导致卵巢卵泡发育和排卵障碍。本项目利用LepR三个酪氨酸活性位点突变小鼠Y123F作为研究对象，同时结合雌激素处理促卵泡发育同步化小鼠模型，分析LepR和FSHR信号通路的作用和关联，以对卵巢卵泡发育和排卵的影响。结果发现随着小鼠成年后（12周龄），突变小鼠变得显著肥胖，血液激素雌激素和滤泡刺激素FSH水平显著降低，而睾酮水平显著升高。伴随有卵巢甾体激素合 成酶基因表达水平显著下降，以及Jak2和Stat3磷酸化水平降低,及Stat5磷酸化水平升高。补充hFSH可以部分恢复内分泌水平的异常；通过人工辅助技术治疗可促排卵获得具有继续发育潜能的卵母细胞，经过离体受精和胚胎移植可以获得正常后代小鼠。但是，LepR基因缺陷导致促排卵受精率和囊胚形成率显著低于野生型（p<0.01），通过卵母细胞基因表达谱测序发现涉及的分子机制与氧化磷酸化有关基因下调有关，提示卵母细胞LepR信号通路独立于FSHR信号通路调节卵母细胞线粒体功能。临床调查结果表明，血浆瘦素受体水平很可能成为一个与瘦素水平或BMI无关，能独立地预测PCOS疾病严重性的新指标。.利用外源雌激素刺激小鼠模型发现，3周龄幼鼠给予雌激素刺激后可引起卵泡同步发育，并停滞在三级卵泡早期；与对照组比较，促排卵获得相似数量的卵母细胞，表明由外源雌激素驱动的卵泡对促排卵不响应，而且没有观察到外源雌激素对卵泡的损害，其卵母细胞经过离体受精、胚胎培养和胚胎移植，能够得到具有正常生育功能的后代。模型小鼠成年后虽然卵巢组织中炎症相关基因异常表达，但没有出现PCOS的典型症状。

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