EMB564蛋白参与玉米种子活力保持的分子机制研究

Seed vigor is an important factor determining maize single-seed sowing. By comparative proteomic analysis, we have recently found that the abundance of maize LEA protein EMB564 is significantly higher in high-vigor seeds than in low-vigor ones. The abundance of EMB564 declines during artificial seed aging. This reveals that EMB564 is closely related to the maintenance of maize seed vigor. It is unclear how EMB564 is involved in the regulation of seed vigor. At present, there are few studies focused on the molecular mechanism underlying crop (including maize) seed vigor. The seeds of maize mutant vp5 (deficient in EMB564 accumulation) and its wild-type Vp5 are selected for experimental materials. We will investigate the interaction between EMB564 and nuclear DNA, the features of DNA sequences binding with EMB564, the ability of EMB564 to cope with reactive oxygen species (ROS) stress, the effects of EMB564 abundance on ROS scavenging, the extent of nuclear DNA oxidative damage and the mRNA expression profiles during seed germination, and the proteins assocaited with EMB564. The research goal is to clarify the molecular mechanism of EMB564 protein involving in the maintenance of maize seed vigor. The expected results of this project will provide important clues for the regulation of maize seed vigor by molecular approaches, and have of potential applications for maize breeding of high-vigor cultivars suitable for single-seed sowing.

种子活力是决定玉米单粒精播的重要因子。我们发现,玉米种子EMB564蛋白与种子活力保持密切相关,EMB564定位于细胞核内染色质的表面上,具有结合DNA、清除活性氧(ROS)的潜力。在此基础上,本项目以EMB564合成缺陷的突变体vp5、野生型Vp5的种子为材料,研究EMB564在离体、活体条件下清除ROS的作用;利用凝胶阻滞实验,捕获与EMB564结合的核DNA片段;利用染色质共沉淀研究活细胞内EMB564与DNA在基因组水平上的互作;利用蛋白质免疫共沉淀及组学技术鉴定与EMB564的互作蛋白;定量比较EMB564表达水平对ROS清除、DNA氧化损伤及种子活力性状的影响;从而揭示EMB564与ROS、DNA的互作在玉米种子活力保持中的作用,阐明EMB564参与玉米种子活力保持的分子机制。预期成果将为玉米种子活力的分子调控提供理论依据,对适合单粒精播的高活力玉米新品种培育具有重要意义。

高活力种子是壮苗、高产的前提，更是玉米机械化精播的必然需求。前期发现，LEA蛋白EMB564在高活力、低活力玉米种子中的含量有显著差异，与种子活力高低呈正相关；EMB564是玉米胚中最丰富的热稳定蛋白，定位于细胞核内染色质的表面上。表明EMB564蛋白与玉米种子活力保持密切相关。. 本项目以EMB564合成缺陷的玉米突变体vp5、野生型Vp5和杂交种郑单958的种子为材料，系统分析了vp5和Vp5种子的蛋白质组背景；分析了EMB564蛋白在玉米种胚不同组织中的含量，着重研究了EMB564蛋白在种子萌发过程中在胚芽鞘中的含量变化和对逆境胁迫的响应，并深入分析了玉米胚芽鞘在伸长过程中的蛋白质组基础；研究EMB564 与核DNA和蛋白质的互作；在拟南芥中过表达验证EMB564的功能，并制备EMB564缺失的玉米种子。发现vp5与Vp5的种子蛋白质组存在显著差异，尤其是多种LEA蛋白(含EMB564)的含量在vp5突变体中明显较低；EMB564蛋白在胚芽鞘中含量最高，在种子萌发32h后EMB564蛋白的含量大幅降低，胁迫处理会加速EMB564蛋白的降解，暗示其可能通过降解参与机体的保护机制；随胚芽鞘的伸长，有71个蛋白质点的丰度发生明显变化，其中多种LEA蛋白(含EMB564)的含量明显下降。上述研究结果表明EMB564与玉米种子活力保持和幼苗建立具有重要调控作用，为进一步阐明EMB564的分子功能提供了新线索。已筛选出与EMB564互作的种胚蛋白，目前正在鉴定；转基因验证EMB564的功能，其植株（尤其是种子）的表型还有待进一步评价。另外，在研究vp5和Vp5种子的蛋白质组差异时，建立并改进了玉米种子蛋白质提取及蛋白质组分析的方法——三氯乙酸/丙酮/苯酚法、氯仿/苯酚法，有效地改善了玉米种胚蛋白质组的分离效果。. 本项目发表相关SCI论文13篇，其中影响因子IF>4 的9篇，累计IF 57，其中最高 10.032，发表在Nature Protocols上；获国家发明专利授权1项。培养博士生1名，硕士生3名，相关毕业论文获河南农业大学优秀博士学位论文(正参评河南省优秀博士学位论文)和河南省优秀硕士学位论文各1篇。

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