扫频超声波诱导蛋白质解折叠、聚集及影响酶解敏感性的机制研究

Ultrasonic pretreatment can significantly improve the enzymolysis properties of proteins, but the mechanism of ultrasonic influence on enzymolysis properties of protein is the key scientific point of ultrasonic sonochemistry and protein chemistry internationally. In the project, β-lactoglobulin as the research model protein, will be pretreated by sweeping frequency ultrasound. The unfolding pathway and thermodynamic stability of native and treated protein will be studied using the stopped- flow spectroscopy technology . The kinetic equation of protein aggregation behavior will be studied using static light scattering dynamic. The influence of sweeping frequency ultrasound on unfolding and aggregation behavior of β- lactoglobulin will be studied systematicly.The effects of sweeping frequency ultrasound on the tertiary structure of β-lactoglobulin will be studied by the near-UV circular dichroism, raman spectroscopy, fluorescence spectroscopy and so on. The change of tertiary structure of β-lactoglobulin would help to investigate the behavior of unfolding and aggregation of protein.The relationships of degree of hydrolysis,conversion rate of protein,characteristics of protein hydrolysates and surface microstructure, morphology of protein can be studied The ultimate goal was to clarify the mechanism of sweeping frequency ultrasound induced protein unfolding, aggregation and influence on enzymolysis properties of protein . The project involves solving scientific problems helps strengthen ultrasonic protein hydrolysis reaction to establish a scientific approach.

超声波处理能够显著改善蛋白质的酶解敏感性，但其影响机制一直是国际上超声化学和蛋白质化学领域亟待解决的热点问题。本项目拟以β-乳球蛋白为模式蛋白，经扫频超声波处理，采用停流-光谱技术研究蛋白质的解折叠动力学及热力学稳定性，借助于静态光散射技术建立蛋白质聚集动力学方程，系统研究扫频超声波对β-乳球蛋白的解折叠和聚集行为的影响规律；借助近紫外圆二色谱、拉曼光谱、荧光光谱等研究扫频超声波对β-乳球蛋白三级结构的影响，从分子水平揭示超声诱导蛋白质空间结构的变化规律；再结合酶解水解度、蛋白质转化率、酶解产物特性等宏观特征和蛋白质表面微观结构、形貌特征等微观信息，研究扫频超声波对蛋白质酶解敏感性的影响机制。本项目涉及科学问题的解决有助于超声波强化蛋白质酶解反应科学方法的建立。

本项目从扫频超声波对β-乳球蛋白的酶解敏感性、聚集动力学、蛋白质分子光谱特性和微观结构特征等方面研究了扫频超声波诱导蛋白质解折叠、聚集及酶解敏感机制研究。全面完成了研究任务，主要研究结论如下：.（1）扫频超声波对β-乳球蛋白的酶解敏感性和产物活性的影响：双频扫频模式的超声预处理对β-乳球蛋白酶解敏感性有显著的改善，组合为68±2/40±2kHz和33±2/28±2kHz双频超声处理后，其水解度分别增加了11.35%和11.53%。扫频单频40±2kHz和双频28±2/28±2kHz超声处理后，其DPPH自由基清除率最大分别为40.26%和40.29%，与不超声相比提高了6.87%和6.90%。说明扫频超声预处理对β-乳球蛋白酶解敏感性有显著的促进作用。.（2）扫频超声波处理对β-乳球蛋白聚集动力学的影响：对β-乳球蛋白经过扫频超声预处理后，在65℃下，40±2kHz超声处理后，β-乳球蛋白的聚集速率大于不超声处理，而随着温度的升高，其聚集速率小于未超声处理。而68±2kHz/40±2kHz双频超声处理，均增加了β-乳球蛋白的聚集速率.（3）扫频超声波处理对β-乳球蛋白理化特性和分子光谱特性的影响：.扫频超声波处理过程中β-乳球蛋白的粒径呈现先增大后减少再增大的趋势。拉曼光谱和圆二色谱结果显示，扫频超声波处理β-乳球蛋白后，其α-heilx结构相对含量减少，无规则卷曲相对含量有所增加。扫频超声波处理还能显著增加β-乳球蛋白表面疏水性，可能是因为超声波处理后，其内部疏水性的基团或氨基酸由于多肽链的伸展更多地暴露于蛋白分子表面，引起表面疏水性的增加。.（4）扫频超声波处理对β-乳球蛋白微观结构特征的影响：通过原子力显微镜可以观察到，超声后，β-乳球蛋白颗粒被破坏分布变得松散。通过扫描电镜可以观察到，不超声处理时，β-乳球蛋白颗粒表面比较光滑，超声处理后，β-乳球蛋白颗粒被破坏分布变得粗糙，蛋白颗粒出现了很多褶皱。.主要成果：发表高水平SCI、EI收录论文6篇，其中5篇论文被SCI 检索、1 篇论文被EI 检索；申请发明专利6件、其中PCT专利1件；有三项成果分别获得了2016-2017年度农业部神农中华农业科技奖科研类成果一等奖、2016年江苏省科学技术进步奖二等奖、2016年中国产学研合作创新成果一等奖。

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