PTEN/SOCS3共缺失调控视网膜Müller细胞分化的神经节细胞轴突导向生长的机制研究

Our previous studies have shown that the retinal Müller cells differentiated ganglion cell axon has limited regeneration capacity. Based on those studies, we will knock out PTEN/SOCS3 genes in murine retinal Müller cell-derived stem cells using the CRISPR-cas9 system in vitro, induce axon growth-related genes to promote axon growth, perform bioinformatics and gene cluster analysis by RNA sequencing, screen for genes related to axonal growth difference, and find out the mechanism of PTEN/SOCS3 co-deletion in regulating axonal growth and its related cell signaling network. Secondly, in vivo studies, we will inject retinal Müller cell-derived stem cells by co-deletion of PTEN/SOCS3 into the vitreous cavity of mice with glaucoma. CTb-594 will be used to show the number, length and shape of the optic nerve axons by 3D imaging. Electroretinogram, high resolution OCT and visual evoked potentials will be used to detect the ability of integration and recovery of visual function. Immunofluorescence staining, qPCR and Western blot will be used to observe the changes of axonal length, shape and number, and changes in related gene expression. Finally, TUNEL technique will be used to analyze the apoptosis of retinal cells, thus revealing the molecular mechanism of PTEN/SOCS3 co-deletion in regulating Müller cell differentiated ganglion cells axon guidance and growth, and laying a solid theoretical foundation for clinical gene therapy of glaucoma.

前期研究发现视网膜Müller细胞分化的神经节细胞轴突再生能力有限。在此研究基础上，我们拟在体外通过CRISPR-cas9系统定向敲除鼠视网膜Müller细胞源性干细胞中PTEN/SOCS3基因，诱导轴突生长相关基因的表达，促使轴突生长，通过RNA测序筛选轴突生长差异基因，并确定调控轴突生长的机制及参与的调控网络。其次体内研究将PTEN/SOCS3基因共缺失的视网膜Müller细胞源性干细胞注入青光眼模型鼠玻璃体腔内，CTb-594显示视神经3D图像分析轴突的数量、长度及走向；ERG、OCT及VEP检测其整合能力及视功能恢复情况；免疫荧光染色、qPCR和Western blot等方法观察轴突的长度、形态和数目变化以及通路中基因的表达，从而揭示PTEN/SOCS3共缺失调控视网膜Müller细胞分化的神经节细胞轴突导向生长的分子机制，为青光眼临床基因治疗奠定坚实的理论基础。

所有类型青光眼的共同结局均是RGCs的选择性、进行性死亡。目前临床上对受损RGCs的修复或逆转仍无行之有效疗法，已成为首位不可逆性致盲眼病。近年来研究表明，被赋予“超级替补”的视网膜Müller细胞在特定条件下可转分化为RGCs。因此，利用内源性细胞转分化为RGCs有望成为治疗青光眼等神经退行性疾病极具潜力的手段之一。我们前期研究发现，哺乳动物视网膜Müller细胞转分化为RGCs的能力有限，且RGCs轴突生长发育不良。本课题组采用多种干预方式，提高了视网膜Müller细胞分化为RGCs的能力，同时促进了轴突的再次生长，但仍无法有效建立传导视觉信息的功能。为了解决轴突的持续生长发育及正确导向大脑投射区等关键性难题，体外研究通过CRISPR-cas9定向敲除鼠视网膜Müller细胞源性干细胞中PTEN/SOCS3基因，诱导轴突生长相关基因的表达，促使轴突持续生长。同时采用AAV-STAT3转染视网膜Müller细胞源性干细胞，联合Rho-ROCK信号通路抑制剂(Y27632)体外诱导其分化为RGCs及轴突再生，并对下游基因的表达进行了检测。体内研究采用改良的方法制作青光眼模型，将PTEN/SOCS3基因共敲除及AAV-Stat3转染的视网膜Müller细胞源性干细胞注入青光眼模型鼠玻璃体腔内，检测了再生的RGCs在视网膜内的整合能力以及视功能恢复情况；探讨了PTEN/mTOR、SOCS3/STAT3以及STAT3/Y27632通路中相关下游基因的变化。明确了其调控视网膜Müller细胞分化的RGCs及轴突导向生长的分子机制。结果显示，两种调控方式均能显著促进轴突的再生，PTEN/SOCS3基因共缺失的调控效果优于STAT3/Y27632，体外研究轴突生长可达3500μm，但体内研究尚未能实现视路的完整重建。该研究成果已完成了2篇论文的投稿。视网膜Müller细胞源性干细胞分化的相关研究已发表SCI论文2篇（Cell Physiol and Biochem；J Cell Mol Med）；同时探讨了利用外周血T细胞分化为RGCs的途径，为青光眼神经再生探索了一条新的治疗策略，已发表论文1篇（J Cell Physiol）。在实验过程中，改良了手术操作器械以及实验操作，申请并获批了3项专利，另有2项RGCs神经保护药物专利已提交国家知识产权局，正在申请中。

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