一个新的调控视网膜Müller细胞分化的神经节细胞轴突导向生长的miR-124及其机制研究

In our previous study, we found that ganglion cells derived from retinal Müller cells have defects in axon growth. In this project we speculate that miR-124 promotes the navigation and growth of retinal ganglion cells derived from Müller cells. To test our hypothesis, we will use miR-124 to induce axon growth of differentiated ganglion cells in vitro, and elucidate the underlying regulatory mechanisms. Next, we will transplant stem cells derived from Müller cells transfected with lentivirus vectors overexpressing miR-124 into the eyes of the glaucoma model rats, ERG and VEP are performed to detect the changes in vivual function, anterograde tracer is used to display 3D image of optic nerve fibers to analyze the ganglion cell axon growth, morphology, migration and the ability to integrate, ISH is performed to detect the miR-124 ’ expression and distribution, Immunofluorescence, qPCR and Western-blot analysis are performed to detect CoREST, REST, Sema3A, NRP-1 mRNA and protein. Finally, TUNEL technique is performed to analyze the apoptosis of retinal cells. The completion of this project will help reveal molecular mechanisms and evaluate side effects of miR-124 in the regulation of axon navigation and growth of ganglion cells derived from Müller cells, and promote translational research of miR-124 in gene therapy of glaucoma.

我们前期研究发现视网膜Müller细胞分化的神经节细胞轴突生长发育不良甚至缺失。本项目中首先体外研究拟采用miR-124上调轴突导向因子促使分化的神经节细胞轴突的生长发育，并确定其调控机制。其次将体外转染miR-124过表达慢病毒载体的Müller细胞源性干细胞移植到青光眼模型鼠眼内，ERG和VEP检测视功能变化，顺行示踪剂神经纤维3D图像分析分化的神经节细胞轴突生长的长度、形态、迁移导向及整合能力，ISH检测miR-124的分布及表达变化，免疫荧光染色、qPCR和Western-blot等方法检测CoREST、REST、Sema3A、NRP-1 mRNA及蛋白的表达差异。最后采用TUNEL技术分析视网膜细胞的凋亡情况，从而揭示miR-124调控Müller细胞分化的神经节细胞轴突导向生长的分子机制及其副作用，为临床基因治疗青光眼奠定理论和实践基础。

青光眼是世界上首位不可逆性致盲眼病，以视神经损害和视野缺损为共同特征。视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的选择性、进行性死亡是青光眼视神经损伤的共同通路和最终结局。目前，对青光眼的治疗只能尽可能阻止其病程发展，减少RGCs的丧失，保护和延缓视神经损害，但迄今为止仍无法行之有效修复或逆转已损害的RGCs。近年来大量研究发现，视网膜Müller细胞在特定条件下可去分化为视网膜干细胞，继而分化成RGCs。然而我们的研究发现，视网膜Müller细胞源性干细胞自然分化成RGCs的数量有限，仅为10%左右。本课题组采用Atoh7基因促使RGCs大量定向分化，分化率高达50.4%。遗憾的是，分化的RGCs轴突生长发育不良，长度也仅为600µm。microRNAs是一类具有全局调控作用的小分子调控物，与靶基因mRNA上的3´端非翻译区结合，从而从转录后水平抑制靶基因的表达。本研究结果表明，miR-124是通过转录后水平与沉默转录因子抑制物REST的辅助因子CoREST的3´-UTR结合，抑制了CoREST的生物功能。由于CoREST对NRP-1的转录起直接的抑制作用，因此miR-124是通过转录后水平直接抑制CoREST，从而使NRP-1的转录抑制得以解除，达到上调NRP-1的作用。同时CoREST的表达受到抑制，位于REST上DNA结合域的C端无CoREST结合，导致REST功能丧失，从而间接促进Sema3A基因表达上调。由此，miR-124可通过直接抑制CoREST和REST的表达进而间接促进Sema3A及其受体NRP-1的转录与结合，启动了RGCs内的信号传递，促使了RGCs的轴突再生，再生的轴突长度达2000µm以上。RGCs的再生将对临床青光眼基因治疗具有重要意义。

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