IP10基因重组新城疫病毒靶向抗肝癌作用研究

Newcastle disease virus（NDV）can copy in tumor cell and displays oncolytic ability without harm normal cell, furthermore, NDV can induce specific and non-specific immune response to kill cancer cell. IP10 can inhibit tumor angiogenesis and suppresses tumor growth by chemotaxis to attract and activate T lymphocytes、NK cell to tumor site. IP10 has showed a good effect for anti-hepatocellular carcinoma (HCC) in our early phase research. Endoglin is one of the hallmarks of tumor and can be use as the target of biotherapy of hepatocellular carcinoma. In this project, in order to prepare HCC-targeted PILs (Pegylated immunoliposomes) vaccine, the recombinant NDV-IP10 with hTERT promoter inserted was reconstructed by reverse genetics, and covered by nano-liposomes cross-linked with endoglin single-chain antibody. To study antitumor effect in vitro and in vivo, this vaccine was transfected into tumor cells and tumor vascular endothelial cells, and also delivered into NOD-SCID mouse bearing HCC with reconstructed human immune function. The PILs tumor vaccine will realize antiangiogenesis, anti-tumor immune response and NDV oncolytic ability multiply antitumor function obtained from IP10, NDV, endoglin single-chain antibody. The research of antitumor effect and mechanism of the PILs tumor vaccine will contribute to explore a new strategy for cancer biotherapy.

新城疫病毒（NDV）不仅在肿瘤细胞内大量复制产生溶瘤作用（对正常细胞无害），而且能诱导肿瘤局部产生免疫反应杀伤癌细胞。IP10既能直接抑制肿瘤新生血管生成，还能趋化附吸激活的T细胞、NK 细胞至肿瘤组织部位实现抗瘤作用。Endoglin是肿瘤新生血管内皮细胞的标记分子。本课题在前期已完成的IP10基因体内产生一定的抗癌作用基础上，以本研究室分离筛选得到的一株NDV病毒为载体，运用反向遗传操作技术，构建带肿瘤特异性启动子hTERT的NDV-IP10重组病毒，用PEG修饰的纳米脂质体包被后，偶联Endoglin单链抗体，制备成PILs疫苗，感染肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞，完成体外相关实验。最后，将该疫苗导入重构人体免疫系统的荷人肝癌SCID鼠体内，研究IP10、NDV、单链抗体三重靶向抗癌效应及其可能的分子免疫学机制，为肿瘤生物治疗提供新策略。

新城疫病毒（NDV）不仅具有溶瘤作用，而且能诱导肿瘤局部产生免疫反应杀伤癌细胞。干扰素γ诱导蛋白10（IP10）既能直接抑制肿瘤新生血管生成，又能趋化激活的T细胞至肿瘤组织实现抗瘤作用。本项目拟运用反向遗传操作技术，构建NDV-IP10重组病毒，运用纳米脂质体包裹NDV-IP10靶向定位到肿瘤组织，研究二者联合增强抗肿瘤作用及其机制。结果：①成功将IP10-IRES-EGFP基因插入到重组新城疫病毒载体pBRN-PmeⅠ中，构建出重组新城疫病毒质粒（pBRN-IP10-IRES-EGFP）。同时还构建了过表达IP10的慢病毒作为载体对照。②对重组新城疫病毒质粒进行病毒拯救，发现拯救的重组新城疫病毒（rNDV-IP10）能使鸡红细胞发生凝集反应，PCR扩增和DNA测序表明拯救的重组病毒基因组中含有正确的外源基因IP10-IERS-EGFP序列。③体外细胞实验显示rNDV-IP10能感染BHK-21仓鼠肾细胞和人MHCC-97L肝癌细胞，并有效转录表达IP10mRNA和蛋白质，细胞培养上清中能检测到IP10蛋白。④发现野生型rNDV自身对肝癌细胞有杀伤作用，但IP10蛋白作为免疫细胞趋化因子对肝癌细胞增殖无直接影响。同时也发现过表达IP10的慢病毒对肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移无影响。⑤细胞实验发现IP10可影响脐静脉内皮细胞增殖，阻滞细胞在S期，对T细胞具有趋化的作用，表明IP10可能通过影响肿瘤微环境进行抗肿瘤作用。⑥建立昆明皮下荷瘤小鼠动物模型，对小鼠进行瘤内注射IP10病毒，发现重组病毒具有更好的抑制肿瘤生长的作用。⑦对肿瘤组织进行免疫组织化学和流式细胞检测，发现rNDV-IP10重组病毒能够抑制肿瘤新生血管的生成，同时能够趋化机体T细胞到肿瘤部位，进而抑制肿瘤生长。⑧成功制备了能靶向定位到肿瘤部位的叶酸-纳米壳聚糖包裹的重组IP10纳米颗粒（PILs），实验发现肿瘤组织注射有PILs的，瘤组织明显缩小，肿瘤组织内IP10表达明显增多，肿瘤细胞增殖减小，而凋亡细胞增多。本项目构建了具有抗瘤作用的NDV、IP10、叶酸三重靶向抗癌肿瘤疫苗，阐明了其抗癌作用的分子免疫学机制，为肿瘤生物治疗提供了新的策略。

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