人类皮肤来源前体细胞向功能性胰岛素分泌细胞诱导分化研究

皮肤来源的前体细胞（Skin Derived Precursors，SKPs）是一群易于获得、能够在体外长期培养、具有多种分化潜能的成体干细胞。本研究组前期的研究发现，小鼠皮肤来源的前体细胞能够被定向诱导分化成为胰岛素分泌细胞，但人类中未见类似报道。此项目依据本实验室在小鼠模型中建立的研究基础，拟比较人类与小鼠来源的不同，定向诱导人类皮肤来源的前体细胞跨胚层分化成为胰岛素分泌细胞，通过DTZ染色、ELISA检测、RT-PCR、Western blot以及细胞免疫化学等方法对其进行体外检测鉴定；通过肾包囊下移植糖尿病小鼠，检测其体内生物学功能。本项目不仅可以为基础研究中成体干细胞可塑性理论提供理论依据，并且也能为成体干细胞在细胞治疗和基因治疗中的应用提供了理论基础，为糖尿病的治疗提供新的思路。

由于人类皮肤来源前体细胞的体外自我更新和衰老问题具有更重要的研究价值和现实意义，与此同时人类皮肤来源前体细胞的分化受到细胞数量的严重限制，我们将研究重点从人类皮肤来源前体细胞的体外分化转移到人类皮肤来源前体细胞体外自我更新和衰老机制的研究方向上。人类皮肤来源干细胞(hSKPs)是一种真皮来源的具有多潜能的前体细胞，具有非常广泛的医学应用潜能。目前世界范围内大多数的研究都集中在hSKPs的分化潜能与创伤修复上，但是很少有人关注到hSKPs在体外的自我更新问题。本研究组成功地在体外建立了人类皮肤干细胞的分离、纯化、培养体系，通过免疫荧光检测发现hSKPs表达Nestin、Fibronectin、Vimentin等分子标志物，通过RT-PCR检测结果显示该细胞同时表达p75NTR、pax3、slug、snail等基因。通过定向诱导分化，可以将hSKPs成功的分化成为神经谱系细胞、平滑肌类细胞、脂肪类细胞等不同胚层来源的终末分化细胞。本项目中，本研究组首次发现hSKPs从体内分离出来之后，将迅速发生细胞衰老(cellular senescence)，并且很难在体外培养超过4代。这种细胞衰老的现象能够使SA-beta-GAL染色呈阳性。我们发现，在hSKPs发生衰老的过程中信号分子Akt的活性急剧的下降，通过添加PI3K-Akt信号通路特异性抑制剂，我们证明了PI3K-Akt信号通路在hSKPs的细胞衰老过程中具有重要的作用。通过添加PDGF-AA以及bpv（pic）的分子组合，能够有效地激活PI3K-Akt信号通路，并且部分减缓hSKPs的衰老进程，促进hSKPs在体外的自我更新以及细胞球形成能力。通过甲基纤维素的半固体培养以及定量定向诱导的实验发现，PDGF-AA以及bpv（pic）对hSKPs自我更新的促进并不会改变其分化的潜能。通过WesternBlot以及RNAi等技术，发现p53、p21、p16等分子在hSKPs细胞衰老过程中起着重要的作用。通过对bmi-1以及EZH2等表观遗传调控分子的研究初步探讨了hSKPs细胞衰老过程中表观遗传水平的变化。通过研究氧化压力的变化，DNA损伤水平以及3种不同3D培养环境的改变，探讨了促使hSKPs在体外发生细胞衰老的真正原因。

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