云南籍扩张型心肌病患者P5CR基因外显子缺失突变研究

Dilated cardiomyopathy (DCM), the etiology of which remains unknown, is the common cause of heart failure. It is considered to have a high incidence and poor prognosis. Clinically, early diagnosis and treatment of DCM still leaves a lot to be desired. According to the researches at home and abroad, the occurrence of DCM is closely related with the gene mutation. Ventricular remodeling is characterized by changes in the content and structure of myocardial collagen. Pyrroline-5-carboxylate reductase  (P5CR) is the key enzyme to synthesize proline, which is the principal amino acid of myocardial collagen. Based on the fact that the exon 5 deletion mutation of P5CR was found in patients with DCM and the protease activity of P5CR mutant is lower, this study aims to explore the relationship between gene mutation and DCM. In the research,we will use the technique for sequencing nucleic acids，X-ray crystallography in combination with a variety of other biochemical techniques to explore the exon deletion mutations of P5CR in DCM, the enzyme kinetics and crystal structure of mutant P5CR. A complete acquaintance with the distribution of exon deletion in DCM patients would provide gene targeting for early diagnosis and treatment of DCM. The elucidation of function and structure of P5CR protease mutant contributes to better understand the pathogenesis of DCM.

扩张型心肌病（DCM）是导致心力衰竭的常见原因，其病因不明、发病率高、预后极差，早期诊断治疗是临床亟待解决的问题，国内外研究发现DCM与基因突变密切相关。吡咯琳-5-羧酸还原酶（P5CR）是脯氨酸合成代谢途径的关键酶，脯氨酸是心肌胶原蛋白中最丰富的氨基酸，胶原含量和结构的改变是心室重塑的主要原因。在发现DCM患者P5CR基因第五外显子缺失突变及该突变体酶活力减弱的基础上，本项目拟采用核酸测序方法筛查DCM患者白细胞P5CR基因外显子缺失分布情况，采用酶学及结构生物学方法分析P5CR突变体酶活性及其X射线晶体结构，以探索P5CR基因突变与DCM的关系。详细了解DCM患者基因外显子缺失分布情况，可为DCM的早期诊断及治疗干预提供明确的基因靶向，明确P5CR缺失突变的功能与结构有助于深入了解DCM的发病机制。

扩张型心肌病（DCM）是导致心力衰竭的常见原因，其病因不明、发病率高、预后极差，早期诊断治疗是临床亟待解决的问题，国内外研究发现DCM与基因突变密切相关。吡咯琳-5-羧酸还原酶（P5CR）是脯氨酸合成代谢途径的关键酶，脯氨酸是心肌胶原蛋白中最丰富的氨基酸，胶原含量和结构的改变是心室重塑的主要原因。在发现DCM患者P5CR基因第五外显子缺失突变及该突变体酶活力减弱的基础上，本项目使用生物信息学方法筛选PYCR1基因的错义突变，并进一步预测和评估其在皮肤松弛症及在扩心病中的所起的作用。研究表明，在PYCR1的348个错义突变中共有15个突变同时被SIFT和PolyPhen软件预测为有害突变，且得分最高的R119G和G206W突变已经由前期研究表明与皮肤松弛症具有显著相关性。为了研究P5CR蛋白突变体致扩张型心肌病的结构生物学基础，本项目使用同源模建的方法构建R119G和G206W的三维空间结构，并将其与P5CR野生型蛋白进行比较。通过I-Mutant和Autodock比较表明，P5CR蛋白在突变后其热稳定性及与辅因子的结合能力均有所降低。通过对P5CR野生型蛋白和两个突变体蛋白进行分子动力学模拟表明，P5CR蛋白在第119和206两个残基位点突变后其整体结构，特别是与辅因子结合区域柔性降低，即刚性增强，从而可能会引起辅因子进出蛋白的速率降低。另外，P5CR野生型蛋白与两种突变体在模拟过程中的动态几何属性比较表明，P5CR蛋白突变后其构象柔性的降低主要是由分子内的原子间相互作用数量增加引起的。构建表达纯化R119G突变体P5CR1 蛋白发现，相对于野生型，R119突变为G减少了对底物3,4脱氢左旋脯氨酸的催化效率及对辅助因子结合亲和力，表明R119突变成G可明显降低P5CR1的酶功能。对不同民族P5CR1进行外显子测序发现，P5CR1在转录本形式有缺失，是在第五个外显子缺失（命名缺失体），与野生型比较少了编码31个氨基酸的93个碱基，缺失体和野生型酶的催化效率是类似的，但缺失体蛋白对温度耐受性下降。对心肌病等107例患者样本P5CR、MMP17、MMP7、CEACAM1、CEACAM5全长基因测序已完成，结果在统计中。同时发现P5CR有促进大鼠皮肤创伤愈合的功效。以上研究为深入认识DCM 发生发展的分子机制及早期诊断及治疗提供了新方向，为该项目的进一步拓展奠定了重要基础。

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