维生素D受体基因新突变调控破骨细胞功能致畸形性骨炎分子机制研究

Paget’s disease of bone (PDB) is characterized by highly localized areas of increased bone resorption and disorganized bone remodeling. Genetic factors are the main cause of the disease. Sporadic cases are common in China, but the pathogenesis is not clear. Our previous study detected VDR gene mutation (exon 4, p.E142K) in 1 subject in 20 sporadic PDB patients by using whole-exome sequencing. By constructing the mutant protein structure, we found that the mutation site is located in the VDR protein DNA binding region, and the mutation will significantly enhance DNA interaction. Furthermore, our previous experiments showed that 1,25(OH)2D3 can regulate osteoclast differentiation by binding with VDR. Our project aims to verify the regulation of VDR gene mutation to the target gene at cell level, and then elucidate the molecular mechanism of PDB through VDRE142K knock-in mouse model by CRISPR/Cas9 technology. In addition, 60 PDB patients will be recruited and identify new mutation site in VDR gene using Sanger. This study provides an important basis for revealing the pathogenesis of PDB in China, and provides an important target for the research and development of drugs for the treatment of osteoporosis.

畸形性骨炎（PDB）以骨吸收和骨重建加速为特点，遗传基因突变是其主要发病原因，国内以散发病例多见，发病机制不明。我们前期在20例散发性PDB患者中通过全外显子组测序，发现1例维生素D受体（VDR）基因外显子4存在p.E142K位点突变。通过构建突变体蛋白质空间构象发现该位点位于VDR蛋白DNA结合区，该突变会显著增强与DNA相互作用，改变蛋白质活性；同时实验证实1,25(OH)2D3通过与VDR结合在破骨细胞分化不同阶段发挥不同调控作用，我们推测VDR基因p.E142K位点突变可直接影响破骨细胞功能状态。本课题拟通过细胞水平验证VDR突变对靶基因调控及VDR相互作用蛋白亲和力影响，继而通过VDR E142K敲入小鼠模型，在整体水平阐明该突变调控破骨细胞功能致PDB确切分子机制。本研究不但为揭示国人PDB发病机制提供重要依据，而且为研发治疗骨质疏松症抑制破骨细胞活性药物提供重要靶点信息。

畸形性骨炎（Paget's Disease of Bone，PDB）是一种临床罕见的慢性进展性代谢性骨病。主要特征为骨吸收增加，随之代偿性新骨形成，导致病变部位骨硬化、骨小梁粗大等。临床表现为：骨痛、头痛、颅骨增大，继发性骨关节炎，神经受压、听力减退及病理性骨折等。因此，本病致残率与致死率均非常高。.目前畸形性骨炎的发病原因及机制目前仍未完全明确，遗传和环境因素在该病的发生、发展过程中均发挥作用。对其病理机制研究显示病变部位破骨细胞数量增多、细胞体积变大、细胞核增多。因此，针对调控破骨细胞的信号通路相关基因，一直是研究热点。.本研究通过收集国人大样本量的畸形性骨炎患者临床信息，全面分析中国散发性畸形性骨炎患者临床表型特征，揭示疾病表型的东、西方遗传背景差异，完善了国人畸形性骨炎表型谱。同时，开展了长期治疗和随访工作，探索不同机制药物（双膦酸盐、RankL单克隆抗体、降钙素等）治疗效果及建立疾病临床转归数据库，包括临床症状、血碱性磷酸酶和骨转换生化标志物ß-CTX等指标变化等具体数据，对临床开展早期诊断、规范诊疗和随访，具有重要指导意义。.更为重要的是，我们通过Sanger测序及深度测序技术，完成了VDR基因及涉及破骨细胞激活的NF-kB信号通路相关基因的测序。遗憾的是，并未检测出VDR基因突变位点，经全面分析VDR基因相关的单核苷酸多态性（SNP），也未获得具有统计学意义的遗传变异。然而，在散发性患者中鉴定出2例患者携带SQSTM1基因M404T（c.1211T>c）杂合突变，功能研究正在开展中；此外，利用生物信息学技术，富集分析导致疾病发生之可能信号通路发现：不同于常见的NF-kB信号通路，本次所有潜在致病基因在神经退行性变（包括WNT16、RYR3和RYR1基因）和肌萎缩侧索硬化（ALS，包括HNRNPA2B1、NUP205、CAPN2和NUP214基因）的途径中显著富集，特别是富集在RNA转运和Apelin信号通路上，并鉴定出上述7个基因的15个突变位点，说明畸形性骨炎与多系统蛋白病之间具有重要内在联系。相关研究正在开展当中。.因此，本项目的开展具有重要的临床价值，不但对临床规范诊治畸形性骨炎具有重要指导意义；而且将为后续制定畸形性骨炎的临床规范诊治等指南制定提供强有力的依据。同时，为后续揭示国人畸形性骨炎发病机制开拓了新的思路，提供重要理论和实验研究依据。

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