基于无细胞体系的非天然氨基酸高效精准嵌入蛋白质的方法及机理研究

By transforming the translational machinery in cell-free systems, unnatural amino acids (uAAs) with diverse side chains can be incorporated into proteins. It offers great opportunities to design a number of novel proteins with various structures and functions. However, finding optimal solutions to overcome the low incorporation efficiency problem has been a big challenge. Our previous work demonstrates that the gene characteristics around the incorporation sites have a strong correlation with the incorporation efficiencies. To explore the sequence-function correlation, cell-free protein synthesis system could serve as a robust and fast high-throughput platform by directly using PCR products as the gene expression templates. The amber suppression approach will be adopted for the uAA incorporation. By using different reporter genes as the model systems, we will construct a deep mutational pool with amber codon TAG site mutations, and then perform the high-throughput analysis of the reporter signals by using the cell-free platform. Based on a large amount of data, the relationship between the gene characteristics around the TAG sites and the uAA incorporation efficiencies could be quantified. The studies in this project can not only build a rational design principle for guiding the efficient and site-specific uAA incorporation, but also expand our understanding on the biochemistry of the protein synthesis and how the unnatural elements work in the life systems.

基于无细胞合成体系，通过改造蛋白质翻译机器将含有丰富侧链基团的非天然氨基酸嵌入蛋白质，为设计多样化新型结构和功能的蛋白质给予了新的契机。但是一直困扰该领域的一大挑战是需要解决非天然氨基酸的低嵌入效率问题。申请人在前期的研究工作中发现，非天然氨基酸插入位点附近的基因序列特征和嵌入效率有关联。为探究相应的序列-功能关系，本项目将建立直接以PCR产物为模板的无细胞蛋白质合成体系作为高通量表征平台。采用琥珀抑制作为非天然氨基酸的嵌入手段。然后以不同报告基因作为研究对象，构建不同琥珀密码子TAG插入位点的突变库，通过无细胞合成平台高通量快速合成报告蛋白和进行信号分析。最后基于大量的数据进行TAG位点所处基因序列特征与非天然氨基酸嵌入效率的关联分析。该研究不仅可以建立理性设计原则用于指导高效精准的非天然氨基酸嵌入，而且能进一步加深认识蛋白质合成生物化学，并拓展我们对非天然元件在生命体系的作用认知。

无细胞非天然蛋白质合成系统作为细胞内非天然蛋白质合成的有力补充手段，可扩展蛋白质的结构及功能，并且已成功应用于蛋白质相关的基础科学研究及工业生产领域。无细胞非天然蛋白质合成系统不需完整的活细胞，而是依靠细胞提取物，添加能量底物及各种辅因子，因此打破了细胞膜的屏障作用，增强了对体系进行工程设计和过程精细调控的灵活性；并可通过引入功能性非天然氨基酸改善蛋白质的特性，甚至赋予蛋白质新的结构及功能，如模拟真核生物的蛋白翻译后修饰、引入正交反应手柄及生物物理探针，合成多聚蛋白质材料等。目前无细胞非天然蛋白质合成系统中，终止密码子抑制是最为广泛使用的非天然氨基酸嵌入方法。然而，整个系统的发展面临重要挑战，包括嵌入效率低及不易扩大等问题。因此本项目聚焦在两方面研究。一是构建高效无细胞非天然蛋白质合成平台，并从报告蛋白选择、底盘细胞种类及培养基选择、稳定DNA模板设计、转录翻译过程的动态灵活调控、反应的最适条件、质粒模板浓度、高活性正交氨酰tRNA合成酶制备及正交翻译组分的最适添加浓度方面对体系进行了探索，旨在最小毒性作用下实现高非天然氨基酸嵌入效率和高非天然蛋白质表达水平。二是探究了影响非天然氨基酸嵌入效率的因素，包括底盘细胞的基因组改造的影响，如TAG至TAA的突变和编码释放因子1的敲除；肽链上非天然氨基酸嵌入位点与N/C端的距离与正交翻译体系嵌入非天然氨基酸的关系；嵌入位点附近的碱基或密码子种类对非天然蛋白质表达的影响，包括第四碱基效应和稀有密码子效应，旨在为非天然氨基酸的高效嵌入提供可供参考的准则。并进一步地对TAG位点所处基因序列特征与非天然氨基酸嵌入效率进行关联分析。本项目建立的无细胞非天然蛋白质合成系统可作为可靠平台用于高效非天然氨基酸嵌入，进而利用非天然生物元件按需合成非天然蛋白质。此外，随着无细胞非天然蛋白质合成系统的发展，在生物催化和生物医药领域具有重要的应用潜力。

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