哺乳动物细胞抗体人工进化平台的研究

Antibodies have a wide range of application in scientific research, clinical diagnosis and treatment. In vitro antibody evolution which was based on the in vitro antibody display, such as ribosome display, phage display, bacteria display, yeast display and mammal cell display, is a major breakthrough in the field of antibody technology. Coupling in vitro somatic hypermutation (SHM) with mammalian cell display, mimicking the process of antibody affinity maturation in mammalian B cells, offers an innovative technology in antibody discovery and optimization. However, this technology is at the initial stage and there is little information on the systemic study of the efficiency of the diversity generation of the antibody gene pool produced in the mammalian cells. Furthermore, as cell display technology, the mammalian cell antibody evolution platform can improve not only the affinity, but also many other properties such as specificity, mammalian cell expression level, or stability, but this advantage has not yet been fully exploited. Our lab has established the unique mammalian cell platform for antibody evolution coupling in vitro SHM with mammalian cell display. In this study, we will perform the following two in-depth study on our established platform, 1) the study on the efficiency of the diversity of the antibody gene pool produced in the mammal cells; 2) the study on the optimization of both the affinity and the specificity of the antibody using this platform. Our work will further improve this mammalian cell platform and expand its application.

抗体被广泛运用于科学研究、临床诊断和治疗的各个领域。建立在抗体展示系统（核糖体展示、噬菌体展示、酵母展示、细菌展示及哺乳动物细胞展示）基础上的抗体体外进化技术，是抗体技术领域的一次重大突破。将哺乳动物细胞抗体展示与体细胞高频突变结合，模拟哺乳动物 B 细胞内抗体亲和力成熟过程进行抗体体外进化，是极为巧妙和创新的策略。但该技术处于起步阶段，缺乏针对抗体基因库多样性产生效率的系统和深入研究。此外，哺乳动物细胞抗体进化平台一个很大优势是不仅能进行亲和力优化，还可针对抗体的其他特性如特异性，表达，热稳定性等进行优化。但这一优势还未被充分发掘。申请者所在实验室已经结合体细胞高频突变原理，建立了自己特有的哺乳动物细胞抗体人工进化平台。本项目中，我们将对此平台进行以下两方面的深入研究：1）抗体基因库多样性产生效率的研究；2）抗体亲和力和特异性同时优化的研究。以进一步完善该进化平台并拓展其应用。

抗体被广泛运用于科学研究、临床诊断和治疗的各个领域。建立在抗体展示系统（核糖体展示、噬菌体展示、酵母展示、细菌展示及哺乳动物细胞展示）基础上的抗体体外进化技术，是抗体技术领域的一次重大突破。将哺乳动物细胞抗体展示与体细胞高频突变结合，模拟哺乳动物 B 细胞内抗体亲和力成熟过程进行抗体体外进化，是极为巧妙和创新的策略。申请者所在实验室已经建立了自己特有的哺乳动物细胞抗体人工进化平台。本项目中，我们进一步完善了该进化平台。首先，我们构建了一个高效的 AID 酶并优化了AID 酶的转染策略。这些改变大幅度提高了抗体基因的突变率和突变类型种类数（均增加了 10 倍以上），显著增加了抗体/其他蛋白质的亲和力成熟效率。其次，我们利用CRISPR/Cas9技术通过定点插入获得了细胞株T31，该细胞株的目的基因转录水平和目的蛋白的表达水平/展示水平都高于之前通过随机插入的方式获得的CHO-puro细胞株，且T31细胞株上展示的抗体有更高的突变率，因此T31细胞株能更好的应用于抗体和其他蛋白的进化。最后，为了同时优化抗体的稳定性和亲和力，我们驯化获得了耐热 CHO 细胞。在此基础上，探索了新的高效人工进化流程，对抗体的稳定性和亲和力同时进行优化，获得了比野生型抗体熔解温度（Tm 值）提高了12℃且亲和力提高了160倍的抗体突变体。这些都可应用于不同抗体和蛋白的优化，扩展了哺乳动物细胞抗体人工进化平台的应用。

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