长效可溶性TNFα p55蛋白持续靶向阻抑急性肝损伤信号通路的疗效与机制研究

TNFα－TNFR p55及Fas L－ Fas 通路是急性肝损伤中肝细胞凋亡、坏死的两条主要信号传递途径，其中TNFα－TNFR p55为优势通路。申请人通过基因工程方法获得具有持续阻抑TNFR p55作用长效可溶性TNFαp55蛋白，初步研究表明其可明显降低LPS/GaIN诱导急性肝损伤小鼠的死亡率。在此基础上我们提出了"持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体（TNFα p55）是阻止急性肝损伤发生有效策略"的假说，并拟进一步在各类急性肝损伤动物中验证长效可溶性TNFαp55抵抗急性肝细胞坏死、降低死亡率的疗效。同时通过检测肝细胞TNFα－TNFR p55下游凋亡通路信号及炎症细胞募集因子的变化深入探讨其作用机制。从而为本课题组提出的抗急性肝损伤理论提供全面的动物实验依据。

通过经基因工程制备的长效可溶性TNFαp55蛋白治疗4种不同类型急性肝衰竭的疗效研究，以验证申请人提出的“持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体（TNFα p55）是阻止急性肝损伤发生有效策略”的假说。.在三年的研究中，课题组成功建立了代表四种不同发病机制的急性/慢加急性肝衰竭动物模型。分别通过LPS/GaIN、TNFa及CpG制作24小时内发生大面积急性肝细胞坏死、死亡率在60-80%的急性肝衰竭模型以及反复异种白蛋白刺激联合LPS/GaIN第二次打击造成的肝纤维化基础上的慢加急性肝衰竭模型。通过可持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体活性的长效可溶性TNFR对上述急性肝衰竭动物模型进行干预，获得如下结果：1）长效可溶性TNFR可完全阻断I型TNFα受体下游的凋亡信号通路，肝脏caspase 3活性明显低于模型对照组，且与健康动物无显著性差别。肝组织TUNEL组化染色结果与caspase 3活性一致。2) 持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体使肝脏组织基本不发生坏死和继发炎症改变。半定量injury score显示长效可溶性TNFR处理组的injury score与健康动物处于同等水平，而明显低于模型动物组。3）完全阻断I型TNFα受体还能明显抑制肝细胞坏死、炎症导致的系统性炎症反应综合症（SIRS），减少对肝外其它重要脏器的影响。4）长效可溶性TNFR处理模型动物的死亡率为0，而对照组为60-80%。.由于长效可溶性TNFR通过持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体持续阻断肝细胞膜I型TNFα受体几乎完全抑制肝细胞凋亡导致的急性坏死、防止肝脏炎症出现，进而降低了SIRS的严重程度，从而使长效可溶性TNFR防治组的死亡率有80%降低至0..上述研究验证了申请人提出的假说，从而为抗急性肝细胞坏死新药研发及急性肝衰竭的早期治疗策略理论的建立提供了依据。.在本基金资助期间，关于长效可溶性TNFR防治急性肝衰竭动物的研究结果获得2012年47th欧洲肝病年会（EASL）的Young Investigator Award。防治慢加急性肝衰竭动物的研究结果已被PLOS ONE修回。关于研制长效可溶性TNFR融合蛋白策略的结果发表在2102年的Biotechnology Letter杂志（IF 1.6）。

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