脂代谢中微效多基因协同作用致遗传性高胆固醇血症的机制研究

Familial hypercholesterlolemia (FH) is a autosomal dominant disorder, the higher rate of premature coronary heart disease has been concerned by the world. But our country still have not enough attention. With standard molecular diagnostic techniques, a familial hypercholesterolaemia-causing mutation can be detected only in 30% of patients with FH. Recent researches have showed a substantial polygenic contribution might add to the variable penetrance of FH. We performed target exome sequencing of 95 genes by previous National Natural Science Foundation and detected a great number of single nucleotide polymorphism (SNP).We found 12 high frequency of SNP, but it is not clear that how to dig out the key locations from a FH and whether these SNPs affect cholesterol metabolism andinteraction? We hypothesized that "In addition to the monogenic mechanisms in FH subjects, there may also exist polygenic co-effect". This project will first study the Northern Han FH nuclear family by a larger sample, use the target exome sequencing chip to array genotype; use bioinformatics method to predict the 12 SNPs influence on cholesterol metabolism; use the single-point mutation and two-point mutation, single transfection and co-transfection and siRNA to specify the SNPs; observe the effect of variation of protein on LDL receptor function and cholesterol metabolism; enlarge the sample detection of 12 SNP in undetected mutations in patients with FH to verify our hypothesis. This is important for the early diagnosis of FH.

家族性高胆固醇血症（FH）是常见单基因遗传病，因高冠心病风险受国际高度关注。研究发现LDL受体等3种FH致病基因突变仅能解释30%患者，其余患者病因不明。新近报道，脂代谢相关多个微效基因协同作用也参与FH发病；我们前期在国家自然基金资助下构建了脂代谢相关95个基因外显子捕获芯片，在未检测到致病突变的FH患者中检测到大量SNP，其中12个频率较高，但它们是否是FH关键基因位点、并通过协同作用影响胆固醇代谢有待研究。我们提出"FH发病除单基因致病机制外，可能还存在多基因协同作用机制"的假说。拟收集北方汉族FH核心家系，利用外显子芯片进行基因分型；生物信息学预测12个SNP功能；以肝细胞为模型,采用单点和双点诱变、单转染和共转染及基因沉默技术，分别观察12个SNP及组合所编码变异蛋白对LDL受体功能和胆固醇代谢的影响；在未发现突变的患者中检测12个SNP；验证假说。本项目对FH早期诊断意义重大。

FH纯合型是罕见病，是胆固醇增高导致冠心病的典型范例，患者青少年期即可发生冠心病心梗，是冠心病最高危的人群。本项目在完成收集101例临床确诊为FH纯合型患者的基础上，自行设计构建升级版的脂代谢相关基因SNP及其外显子捕获芯片，结合二代测序分析患者高发SNPs及基因热点突变，获得成果如下：（1）发现大量SNPs和新位点，但排名前50位SNPs中仅5个与英国评分模型中的SNP重合，（2）FH患者发现主要致病基因突变的同时还检测到一些SNPs，证实了FH除主效基因还存在辅效基因共同促进FH发病的假设，更新了人们认为FH仅为单基因疾病的认识。（3）生物信息分析发现60个可能的致病性变异（SNVs），分别位于LDLR、APOB、PCSK9与LDLRAP1基因上，其中11个新位点；还发现8个可能致病的插入或缺失变异（indels），位于LDLR基因，其中5个新位点。（4）患者致病基因以LDLR基因突变为主，以复合杂合居多，发现其中3个高频突变位点是W483X，H583Y与A627T，占42.% 主要分布在安徽、河南与湖北省，这些发现有利于缩小测序池，为FH的快速筛查早期诊断奠定了实验基础。（5）鉴别诊断出15例植物固醇血症（STSL）患者，STSL为罕见的隐性遗传性疾病，但是依折麦布联合他汀可预防心血管发生，因此本项目不仅对该病患者早期诊断意义重大，而且为我国罕见病增加了新的数据库。（6）创新型建立了LDLR双突变的荧光表达载体，未见相关报道，有助于发现突变或SNP对LDL代谢的叠加作用，与WT组相比，W483X等突变体对细胞LDL的内吞能力显著降低。虽然目前未找到合适的SNP组合，望扩大样本进一步分析SNP组合特点，作出我国的评分模型。本项目发表了论文16篇，其中SCI论文11篇，课题组成员获得国家自然科学基金3项，其他行业课题5项；培养研究生7名；参加国际会议发言多次并举办了中国-荷兰血脂论坛。此外，协助罕见病纯合FH的孤儿药--降脂新药瑞百安在我国上市并参与中华慈善总赠药项目。总之，本项目对于我国FH研究起到积极的推动作用，带来良好的社会效益，对于FH高危人群的早期诊断早期治疗意义重大。

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