内脏异位合并先天性心脏病中DNAH8基因缺陷致病的分子机制

Heterotaxy with congenital heart disease (heterotaxy/CHD) is a spectrum of complicated congenital anomalies with high mortality and morbidity. Studies have shown that its etiology and pathogenesis are closely related to cilia dysfunction. Based on the previous research, we propose that DNAH8 gene defect as a candidate gene for cilia motility disorder may be an important pathogenic factor of heterotaxy/CHD. This study is intended to complete the following parts: ① to analyze the DNA sequence, expression characteristics and regulation mechanism of DNAH8 gene in patients with heterotaxy/CHD; ② to detect The effects of DNAH8 gene mutation on the occurrence, movement and ultrastructure of the dynamic cilia in human respiratory epithelial cells. ③ to establish the stem cell line hiPSCs from patients and to detect the effects of DNAH8 gene mutation on hiPSCs, differentiation, morphology and function of cardiac myocytes. ④ to observe the effects of DNAH8 gene mutation on fetal dynamic cilia, visceral position and cardiac development phenotype by using zebrafish and mouse models. The results will help to illustrate the pathogenesis of heterotaxy/CHD and provide evidence for early intervention of the disease.

内脏异位合并先心病病情复杂、病死率高，其病因和发病机制与纤毛功能障碍有着密切的内在联系。基于前期研究提出以下课题假说：DNAH8基因缺陷作为纤毛运动障碍的候选基因，可能是内脏异位合并先心病重要的致病因素。本研究拟完成：①分析内脏异位合并先心病患者DNAH8基因的DNA序列、表达特征及其调控机制；②在人呼吸道上皮细胞中检测DNAH8基因突变对动力纤毛的发生、运动和超微结构的影响；③建立患者来源诱导多能干细胞hiPSCs，检测DNAH8基因突变对hiPSCs多能性、定向心肌细胞分化、形态和功能的影响；④利用模式动物观察DNAH8基因突变对胚胎动力纤毛、内脏位置和心脏发育表型的影响。研究结果有助于深入解析内脏异位合并先心病的发病机制，为今后开展早期干预研究提供依据。

内脏异位合并先心病病情复杂、病死率高，其病因和发病机制与纤毛功能障碍有着密切的内在联系。本研究主要发现如下：①揭示了内脏异位合并先心病患者的临床特征：本研究将病人分为左位心和非左位心两组，发现左位心组在心脏解剖异常上更易伴随房室间隔缺损、房间隔缺损和单心室，在内脏位置上更易伴随中位肝和无脾。非左位心组更易伴随左位肝。这些发现有助于临床诊疗，在心位已知的情况下，临床医生和影像科医生可以有倾向性地观察其他伴随畸形。②探究了DNAH家族与内脏异位合并先心病的关系：对53个核心家系进行全外显子测序，通过遗传模式de novo、常染色体纯合、复合杂合、X连锁隐性和LOF分析筛选出了63个候选致病基因。其中DNAH11及DNAH2两个纤毛基因的突变频率最高，在LOF中有25.5%候选基因（12/47）与纤毛相关。在所有筛选出的有害基因中，我们发现DNAH家族基因突变占比19.4%（24/124），突变频率从高到低分别为DNAH11、DNAH2、DNAH8、DNAH6和DNAH5，其中除了DNAH8外，其他基因均已被报道与内脏异位相关。③DNAH8基因突变对胚胎动力纤毛、内脏位置和心脏发育表型的影响。鉴于DNAH8在斑马鱼中无同源基因，我们在小鼠模型中利用Crispr-cas9技术，构建DNAH8基因敲除基因小鼠，结果显示DNAH8敲除小鼠的生育能力受到明显影响，纯合子公鼠不育，且可能存在有雄性宫内致死。对野生型、杂合子和纯合子胎鼠ED12.5的胎心进行RNA-seq测序，其中纯合子与杂合子差异表达基因集中在胚胎组织的发育上，这提示了DNAH8纯合致病，也反映了基因缺陷致病的不完全外显。在DNAH8突变携带的病人和其母亲的转录组结果中，显示差异基因主要与心管和心脏发育相关，这也支持纤毛基因DNAH8是内脏异位合并先心病的致病因素。这些结果证明了我们的假说，即纤毛功能与内脏异位合并先心病密切相关，纤毛基因DNAH家族的高频出现充分支持这一点，其中DNAH8与器官发育和心脏发育密切相关，是内脏异位合并先心病的致病基因。本研究明确了DNAH8基因缺陷在内脏异位合并先心病发生中的作用和分子机制，为进一步开展早期干预研究提供了重要参考依据。

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