附睾β-防御素Defb42在精子成熟和免疫保护中的功能研究

已知附睾头部是精子获得运动能力的区段，附睾头部的β-防御素家族成员如bin1b,Defb15等是精子获得和维持运动能力及免疫保护所需，而附睾起始部（精子还不具运动能力）及体部（精子运动维持和增强）的β-防御素Defb42、Defb30等是否也有精子运动相关功能或其它与精子成熟相关的功能还未知。本项目拟通过慢病毒介导的在体基因沉默来研究附睾起始部的Defb42在精子运动、成熟中的功能，同时利用重组蛋白研究其抗菌活性、结合LPS和肝素的活性、以及抑制附睾上皮细胞和免疫细胞炎症因子释放的活性，确认附睾表达的β-防御素具有独特的抑制炎症的活性，而不同于常见β-防御素的促进炎症反应的活性。此外，将利用本室已经制备的大量人类β-防御素蛋白，从防御素家族的角度，在分子和细胞水平探索其结合LPS或肝素等分子的能力、抗菌活性以及对细胞炎症因子释放的抑制能力和可能的机制。

我们分别于原核和真核细胞中成功表达了Defb42蛋白，其中哺乳动物细胞和昆虫细胞sf9表达的Defb42蛋白具有抗菌活性,表现出广谱的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑菌活性，但对白色念珠菌没有活性。利用我们高质量的Defb42抗体，我们将Defb42的表达定位在大鼠附睾起始区段1、2区，并通过western blot,免疫荧光分析，发现Defb42分布于大鼠精子的顶体外膜区域。在筛选出特异敲低Defb42表达的RNAi序列的基础上，制备了对应的慢病毒载体颗粒。在进行附睾起始部在体注射的实验中，我们发现附睾起始区较附睾头部、体部和尾部对刺激更敏感，注射操作本身以及LPS 诱导都会显著的上调炎症相关因子的表达，同时下调Defb42的表达。多次实验的结果表明Defb42和炎症因子的表达呈现负相关，提示炎症反应可能下调Defb42的表达，干扰精子的正常成熟。已知炎症会改变很多Defb基因的表达，在当前的方案中，无法排除手术操作造成的影响，因而对原方案进行了调整。. 我们克隆和表达了23个人类β-防御素家族成员，并重点对DEFB126、114等进行了分析。首先建立了有效的β-防御素重组蛋白制备方法，并在国际上首先报道了DEFB126、DEFB114、DEFB120、DEFB113等的成功表达制备。这些成功案例说明我们的方法对β-防御素家族具有一定的普适性和先进性。我们证明β-防御素的LPS和肝素结合活性是β-防御素具有的普遍特征，但β-防御素的LPS 和肝素结合活性与其抗菌活性没有明显的相关性。深入研究发现，β-防御素至少通过中和LPS，可以抑制模式细胞RAW264.7炎症因子的产生。DEFB126甚至可以进入RAW264.7细胞，因而用DEFB126预处理细胞，在洗掉胞外蛋白后，也能“预防”后续LPS诱导的炎症反应,提示其具有不依赖LPS结合的抗炎机制,虽还不清楚，但可能与p42/44和 p38 MAPK磷酸化有关。另一个β-防御素DEFB114也具有高级结构依赖的LPS中和活性，可在体外实验中保护精子运动活力不受LPS损伤。小鼠实验表明，DEFB114注射可以有效地挽救LPS诱导的小鼠死亡，而且没有明显的细胞和精子毒性，这表明DEFB114具有治疗内毒素休克和死亡的医疗应用潜力。

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