分子改造Levan蔗糖酶拓展转糖基底物特异性研究

结题报告
项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号:
    31070064
  • 项目类别:
    面上项目
  • 资助金额:
    34.0万
  • 负责人:
  • 依托单位:
  • 学科分类:
    C0102.微生物生理与生化
  • 结题年份:
    2013
  • 批准年份:
    2010
  • 项目状态:
    已结题
  • 起止时间:
    2011-01-01 至2013-12-31

项目摘要

结构多样的寡糖库是糖基化修饰和糖链探针研究的基础。糖的多个羟基使特异糖苷合成的化学法步骤繁琐,应用难度大。生物酶法中的糖苷酶法糖基供体为简单糖类且糖基受体多样,工业实用性较好。Levan蔗糖酶能以蔗糖为底物转果糖基合成β-2,6果糖苷键组成的Levan类寡糖和聚糖。微生物来源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同,表现出底物特异性差异,该特性是由酶分子中的某些氨基酸决定的。我们已经筛选到一株高产Levan聚糖的地衣芽胞杆菌,本项目进行该菌株Levan蔗糖酶的分离纯化和转糖基研究,酶基因克隆后序列分析推测酶分子中与转糖基反应的底物特异性可能有关的氨基酸,定点饱和突变建立突变酶库,筛选获得转糖基底物特异性拓展的突变酶。本项目完成不仅可填补国际上地衣芽胞杆菌Levan蔗糖酶系统研究的空白,而且转糖基底物特异性拓展的突变酶可作为酶法合成寡糖或糖苷化合物的有力工具,推进糖基化工程和糖药物的研发。

结项摘要

Levan蔗糖酶能以蔗糖为底物转果糖基合成β-2,6果糖苷键连接的果寡糖和果聚糖。微生物来源的Levan蔗糖酶合成寡糖和聚糖的比例不同,表现出底物特异性差异。本项目分离纯化了地衣芽孢杆菌8-37-0-1的Levan蔗糖酶,分子量约为50kDa,N-端氨基酸序列为KETQDYKKSY。该酶在0.8M的蔗糖溶液(pH 6.5)中,40℃反应24h,合成的Levan果聚糖分子量为2千万,反应48h后,Levan果聚糖的分子量稳定在4 百万。PCR扩增得到8-37-0-1菌株的Levan蔗糖酶基因sacB(GenBank No. KF647836),为1446bp,编码482个氨基酸,理论分子量为53.7kDa,第30-39个氨基酸序列完全对应于纯化获得的天然Levan蔗糖酶N-端氨基酸序列。分别将sacB和sacB-30在大肠杆菌中重组表达,表达sacB的重组菌培养液上清和细胞中均有酶活,而表达sacB-30的重组菌培养液上清没有酶活,细胞内有酶活。重组酶分别经镍亲和纯化,SDS-PAGE结果显示重组SacB-30蛋白为单一带(58kDa),重组SacB蛋白为两条带(51kDa和60kDa),蛋白肽指纹图分析结果均为Levan蔗糖酶。与天然酶相同条件下反应24h,重组SacB-30合成的Levan果聚糖分子量为1千万,反应48h后,果聚糖分子量与天然酶相同,反应中还生成少量果寡糖,鉴定其中三糖为新蔗果三糖(neokestose)和1-蔗果三糖(1-kestose)。重组酶具有广泛的糖基受体底物特异性,能以多种单糖、寡糖、糖醇、多种酚类及短链烷基醇类化合物为糖基受体合成果糖苷。分离获得了4种转糖基产物,果糖基分别以β(2,1)连接到糖受体上,显示出该酶以其他单糖和寡糖为转糖基受体合成果糖苷时具有显著不同于合成Levan果聚糖时的优选β(2,6)区域选择性。生物信息分析推测了Levan蔗糖酶与转糖基反应底物特异性可能有关的氨基酸位点,定点突变筛选获得的六种突变酶都丧失或降低了合成果聚糖的能力,均合成3-8不同聚合度的果寡糖,纯化了9种3-8聚合度寡糖,结构解析发现所有突变酶均改变了糖合成的聚合度,但不改变原始酶合成果聚糖时优势的β(2,6)区域选择性。

项目成果

期刊论文数量(3)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Levan果聚糖的应用与生产研究进展
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2013
  • 期刊:
    生物学杂志
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    陆娟;唐俊;肖敏;屈长青
  • 通讯作者:
    屈长青
Levan蔗糖酶及其在Levan果聚糖合成中的应用
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    --
  • 期刊:
    微生物学报
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    陆娟;卢丽丽;肖敏
  • 通讯作者:
    肖敏
地衣芽孢杆菌产Levan果聚糖发酵条件的优化
  • DOI:
    --
  • 发表时间:
    2011
  • 期刊:
    食品科学
  • 影响因子:
    --
  • 作者:
    陆娟;肖敏;卢丽丽
  • 通讯作者:
    卢丽丽

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其他文献

不同月龄BALB/c小鼠感染甲型H1N1型流感病毒的炎性调控差异研究
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  • DOI:
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  • 发表时间:
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  • 期刊:
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  • 作者:
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  • DOI:
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  • 发表时间:
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  • 作者:
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  • DOI:
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  • 发表时间:
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  • 影响因子:
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我国 RD 资本存量的空间分布特征
  • DOI:
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  • 发表时间:
    --
  • 期刊:
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  • 影响因子:
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  • 作者:
    肖敏;谢富纪
  • 通讯作者:
    谢富纪

其他文献

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肖敏的其他基金

新的具有转糖基活性的唾液酸苷酶的基因发掘、分子改造及其催化分子机制研究
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AI项目解读示例

课题项目:调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要:

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题,其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子,其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而,TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用,影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法,探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用,为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义,并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路:

科学问题:TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达?
前期研究:已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应,但其具体机制尚不明确。
研究创新点:本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线:包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术:TRIM2与病毒RNA的相互作用分析,IFN-β启动子活性检测。
实验模型:使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
      
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