单抗药物纯化的分子机制和过程强化研究

Aiming at the efficient and economic purification of monoclonal antibodies (mAb), new process based on the mixed-mode chromatography (MMC) would be explored with CD20 mAb as the model. Focusing on the molecular mechanism of MMC, the computer-aided molecular simulation methods would be used to study the interactions between the mixed-mode ligand and antibody, and evaluate the modes of antibody binding and elution. A platform based on the molecular simulation would be established for the design of ligand. Some novel mixed-mode ligands would be screened and used for preparing new series of mixed-mode adsorbents. On the other hand, the method of isothermal titration calorimetry (ITC) would be introduce to study the ligand-antibody interactions in the solution and analyze the influences of pH, impurities and some additives on the antibody binding, then the separation conditions would be explored. Based on the studies of molecular simulation and ITC, the adsorbents can be improved and the separation conditions would be optimized, then the process would be intensified for the mAb purification. The purity might meet the demands of pharmaceuticals. In this project new methods based on the molecular simulation and ITC analysis would be established, which would certainly improve the design of new adsorbent and develop new process for bioseparation.

围绕单克隆抗体的经济高效分离，以抗CD20单抗为典型对象，探讨混合模式层析（MMC）分离单抗药物的新过程。从分子机制出发，一方面借助计算机分子模拟方法，分析配基-抗体间分子相互作用，探讨配基结构对抗体结合的影响，构建基于分子模拟的配基设计平台，筛选和优化设计新型配基；另一方面，引入等温滴定微量热法，分析溶液条件、杂质和添加组分等对配基-抗体结合的影响，了解分子作用机制，优化抗体的分离条件；在此基础上，改进分离介质，优化分离条件，从而实现过程强化，达到单抗的经济高效分离，形成单抗药物分离的新过程，纯度达到制剂要求。本项目将建立基于"分子模拟"和"等温滴定量热"的生物分离机制研究新方法，为生物分离介质和分离过程的优化设计提供指导，并推广到其它单抗和生物活性物质的分离纯化过程。

围绕单抗药物的经济高效分离，集中于混合模式层析新方法，一方面从分子模拟入手，构建分子模拟平台，探讨配基－抗体间的分子作用机制，设计新型配基；另一方面从实验研究入手，引入先进分析手段，测定配基-抗体的相互作用，探讨抗体结合和解离机制；在此基础上，以单抗药物分离纯化为目标，制备新型混合模式介质，优化分离过程，实现过程的集成和强化。主要成果包括三个方面：第一，基于分子模拟的新型混合模式配基设计：针对混合模式层析的特点，构建分子模拟新方法，分析配基结构、配基密度、蛋白空间取向等影响，从微观分子尺度揭示了混合模式配基与抗体的作用机制；采用丙氨酸扫描等方法，基于天然配基-抗体的热点残基分析，提出TRP和TYR两种作用模式，设计了新型混合模式配基。第二，配基-抗体相互作用的实验研究：采用等温滴定量热法，测定了配基-抗体结合的热力学变化，分析配基-蛋白的主要作用力，揭示了混合模式吸附的典型特性；采用表面等离子共振法，测定了配基-蛋白结合的动力学和亲和力；采用共聚焦激光扫描显微镜，实时分析介质颗粒内蛋白的分布和变化，探讨了pH影响和不同蛋白的竞争性吸附。第三，新型混合模式介质制备和抗体分离过程强化：针对抗体分离，优化介质孔径、配基密度和孔内接枝，制备了新型混合模式介质；测定多组分蛋白吸附，探讨抗体结合选择性，实现了不同抗体类型/片段的分离；采用混合模式层析，从哺乳细胞培养液中分离单抗药物，包括抗CD20单抗、抗CD52单抗、抗IL-12、抗Her2单抗等，实现了单抗的高效分离，进一步结合扩张床吸附技术，简化分离步骤，提高分离效率，体现了集成分离的优势。本项目研究对分子模拟辅助配基设计、蛋白-配基相互作用研究、新型分离介质研制、单抗药物分离纯化等具有很好的指导和推广作用。

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