hAT-III和hTFPI修饰猪骨髓间充质干细胞纠正异种肝移植术后凝血功能紊乱的研究

With the development of GTKO pig and hCPRP transgenic pig, the hyperacute xenograft response caused by α-1,3-galactose and natural antibody can be efficiently control. But the coagulation dysfunction caused by the coagulation and anticoagulation system incompatibility between the pig and primate causes chronic rejection and reduce the survival time of the grafts. Now evidences have been found that porcine antithrombin-III (AT-III) and tissue factor pathway inhibitor (TFPI) cannot play their roles in human body, which cause the formation of microthrombin, consumptive coagulopathy and finally cause the deaths of grafts and recipient. To solve this problem, we plan to make a transplantation models with pig (as the donor) and monkey (as the recipient) and transfer the human AT-III and human TFPI to the donor MSC and inject the transgenic MSC to the recipient. We plan to observe the survival time, immune response and the coagulation function. In this way, we can find the function of hAT-III and hTFPI in correcting coagulation dysfunction and controlling immune rejection. Our subject will first examine the use of hAT-III and hTFPI in big organ xenotransplantation and make outbreaking progress for the coagulation and anticoagulation incompatibility before the clinical application of xenotransplantation.

随着GTKO 小型猪和转hCPRP 基因猪的问世，由α-1,3-半乳糖抗原和天然抗体引发的异种超急性排斥反应已得到有效控制，但因猪与灵长类动物的凝血-抗凝系统不相容引发的受体凝血功能紊乱，介导了迟发性免疫排斥反应的发生，阻碍移植物的长期存活。目前发现猪源AT-Ⅲ和TFPI 不能在人体内发挥抗凝作用，致使移植物血管内产生广泛微血栓，并继发消耗性凝血障碍，最终导致移植物失活和受体死亡。针对此问题，本课题拟以GTKO.小型猪为供体，恒河猴为受体，建立异种肝移植模型，并采用脂质体法将hAT-Ⅲ和hTFPI.基因导入供体MSC，于术前、术中及术后输入受体体内，观察受体存活时间、免疫排斥发生.率和凝血功能，探讨hAT-Ⅲ和hTFPI 对纠正受体凝血功能紊乱和抑制免疫排斥的作用。本课题的研究，将首次检测hAT-Ⅲ和hTFPI 在异种大器官移植中的应用价值，并为突破人和猪的凝血-抗凝系统不相容。

肝移植是终末期肝脏疾病的有效治疗手段，但供体器官的严重短缺限制了临床肝移植的发展。开展异种移植研究，用动物的肝脏代替人类肝脏进行移植，以解决供肝短缺难题，是移植医学研究者的目标与梦想。综合多种因素，人们认为猪是异种移植最佳供体。GTKO猪的出现解决了异种移植的超急性排斥反应问题，极大推动了异种移植的发展。但是目前异种肝移植仍然面临诸多难题。其中异种肝移植后出现的凝血调节障碍，会导致受体出现血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy, TM）以及消耗性凝血病，最终导致移植肝失功能和受体死亡。.本课题对首次利用猪-藏酋猴的模型进行了异种肝移植的实验。建立了GTKO猪-藏酋猴异种脾窝异位辅助性肝移植模型，通过优化手术方案及术后管理为异种移植提供了研究平台。同时为异种肝移植走向临床提供了实验基础。TF（Tissue factor）的激活被认为是导致异种移植术后凝血功能障碍的主要原因之一。研究表明，过表达人TFPI可能是解决凝血障碍具有重要方法。所以，我们利用GTKO猪-藏酋猴异种移植动物模型及猪主动脉内皮细胞的体外模型探究了异种移植术后TF的起源，并对猪TFPI与人TF的不相容性及其分子机制进行了研究，最后我们尝试使用转人TFPI的猪骨髓间充质干细胞在体外缓解凝血功能障碍。抗凝血酶-3（Antithrombin-III，AT-III）在猪与灵长类动物之间由于存在种属差异，不能在人体内发挥有效抗凝作用，致使移植器官血管内广泛产生血栓，最终导致移植失败。AT-III是血浆中最重要的抗凝物，其由肝脏及血管内皮细胞产生，在肝素的协同作用下与FXa和凝血酶结合发挥抗凝血作用。本实验成功提取GTKO小型猪源性的骨髓间充质干细胞，并使其永生化建立细胞系。进而利用慢病毒感染技术，将人抗凝血酶III（AT-III）的基因转入GTKO猪源性的骨髓间充质干细胞（MSCs）中，使其表达并分泌人源性抗凝血酶III，从而减少异种移植中因供受体间凝血调节因子不相容引起的凝血紊乱。

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