神经元蜡样质脂褐素沉积症致病基因TPP1不同突变的致病性及其与表型的关系

Mutations in TPP1 gene, which encodes peptidyl peptidase 1 (TPP1), cause classic late infantile neuronal ceroidlipofuscinosis (LINCL). With the application of next generation sequencing, a number of novel TPP1 mutations have been identified and new phenotypes have been reported. However, evaluating the pathogenicity of mutations can be challenging. We have reported a compound heterozygote mutation (c.646G>A(p.V216M)，c.1551+1G>A). Our later studies have identified several more mutations in patients with LINCL. Functional studies revealed differences in pathogenicity of the mutations. In this project, we plan to study the damaging effect of the mutations in different sub-regions of TPP1 gene, including the enzyme activity and zymogene expression by constructing TPP1 mutants in vitro. The subcellular localization of TPP1 mutants will be observed to understand the mechanism leading to lysosomal protein abnormal deposition. Mutations-specific model will be produced to study the pathological and behavior abnormalities, in addition to the functional studies. Correlations between functional impairments and clinical phenotypes will be analyzed. This study will provide experimental bases for evaluation of the pathogenicity of TPP1 mutations, which imply significance in the clinical diagnosis and genetic counseling.

TPP1基因编码三肽酰肽酶1（TPP1），突变引起晚婴型神经元蜡样质脂褐素沉积症，二代测序的应用发现更多新的突变和表型，其致病性评价的生物信息学方法具有局限性，有赖于基因型-功能-表型关系的研究。前期课题组对发现的突变p.V216M/c.1551+1G>A及来于不同表型患者的5个突变进行研究，结果显示TPP1表达量和酶活性存在差异。此外，既往研究显示神经元损害与TPP1酶活性存在剂量依赖。因此假设不同突变所致的表型差异可能与功能损害程度相关。本项目拟通过：构建TPP1基因不同突变的细胞转染模型，体外研究不同位点和不同类型的突变对蛋白功能的影响及机制；在此基础上遴选致病性不等的突变位点构建2种点突变小鼠，比较不同突变小鼠主要脑区TPP1表达、酶活性水平、病理损害和行为学等方面的差异，分析功能损害程度与表型的关系。该研究有助于明确TPP1突变致病的一些规律，指导基因诊断和致病机制的研究。

本项目通过构建TPP1基因不同突变的细胞转染模型，包括单突变转染和模拟不同表型患者的复合杂合突变转染，检测突变对TPP1酶活性和蛋白功能的影响及机制，分析酶活性-基因型-表型之间的关系。结果发现：1、残存酶活性与病情程度相关，具有量效关系：JNCL型及SCAR7型残留酶活性大于正常水平的9%，LINCL型均低于9%，提示残留酶活性达到这个阈值可以减轻疾病。该阈值的确定为酶替代治疗量的选择提供了实验依据。2、本研究通过比较最轻的致病性突变与无症状变异（SNP）的酶活性值，确定TPP1基因的生理依赖量（即维持正常生命所需要量）在39.2% ~ 48.7%之间，小于二倍体功能的50%，因而解释了TPP1相关疾病为隐性遗传。3、通过突变的单转染和共转染，确定了不同突变的组合产生不同程度功能损害，对应产生不同的表型谱， 轻损害的基因型可以仅表现癫痫和共济失调，对此类患者筛查TPP1基因突变可减少漏诊。4、确定了15个常见变异（占已报道的病理等位基因2/3以上）的功能结果。通过对蛋白结构的三维分析和细胞定位的分析，探讨了突变的分子机制，发现影响TPP1蛋白结构深部催化结构的错义突变，以及位于内含子区不变剪切点的剪切突变导致的酶活性损害明显，说明突变的类型和突变位置与酶活性相关。对基因型-功能-表型关系的理解有助于判断变异与疾病关系。5、基于上述突变的功能损害程度相关于疾病表型谱的研究成果，我们在智能发育倒退和不明原因的癫痫、共济失调的患者中收集病例进行全外显子组测序并进行基因型-功能-表型关系分析，发现了TPP1、SHROOM4、DEPDC5和PRRT2基因新的非典型表型和基因型，进一步验证了我们的研究结果。.本项目已达到计划要点的研究目标。研究成果对TPP1相关疾病的临床分子诊断、预后判断和酶替代治疗量的选择均具有实际指导意义，所提出的基因生理依赖量及量效关系在决定遗传模式和表型谱中的作用对发现新的表型拓宽了新思路。已发表论文3篇，主要研究结果的论文正在投稿中（Quantitative correlation between the residual activity of tripeptidyl-peptidase 1, genetic damage and the severity of the resulting phenotypes）。

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