BDNF/trkB在鸟类发声核团性别差异中的作用

鸣禽发声核团的雌雄差异非常明显，为研究脑的性别分化提供了很好模型。由于编码脑源性神经营养因子（BDNF）的基因包含雌激素反应元件，其受体trkB与性染色体Z连锁，它们可能在鸟类发声控制核团性分化中发挥作用。由于BDNF/trkB在鸟类发声核团性分化中的作用还没有系统研究，本项目拟开展以下工作：1）检测BDNF/trkB在发声核团（HVC、RA、X、LMAN、DLM）性分化过程（出生后5 -60天）和成年中的表达变化，分析它们与核团性别分化的关系。2）结合神经逆行示踪和BDNF/trkB免疫组织化学双标，以及核团损毁，弄清BDNF/trkB在发声核团间的产生和转运关系。3）通过离体脑片培养，结合带GFP腺病毒标记，比较加入BDNF前后，HVC和X核前体神经元迁移和产生数量的变化，分析BDNF在其中的作用。以上工作不仅能揭示发声核团性分化的神经机制，还可拓展人们对BDNF/trkB功能的认识。

我们首先通过放射性胶质细胞纤维的标记以及VZ区损毁等实验确定了幼鸟白腰文鸟孵化以后HVC神经元在VZ区的主要发源位点及其细胞迁移路径；在此基础上分析了活体情况下HVC细胞在增殖、迁移、分化方面的性别差异，以及离体培养条件下HVC细胞增殖、分化方面的性别差异；随后分析了雌二醇对HVC细胞增殖、分化的调节及其可能机制。我们的结果显示：⑴ 幼鸟孵化后HVC新生细胞主要起源于覆盖在其上的VZ区，其后沿放射性胶质细胞纤维迁移至HVC；⑵与RA、LMAN核不同，HVC细胞在增殖、迁移、分化方面的性别差异造成了最终HVC神经元数目的性双态；⑶雄性脑组织分泌或合成的一些脑源性因子（如雌激素）能促成HVC的雄性化发育；⑷雌二醇能促进P15白腰文鸟HVC对应VZ区内神经干细胞增殖，以及神经元的分化，并进一步发现雌二醇的这方面作用可能是通过上调HVC区域内BDNF的表达而实现的；⑸我们发现在P15白腰文鸟发育脑HVC中，雌二醇对BDNF的调节与VEGF、上皮细胞无关（有报道表明成年雌性金丝雀的HVC中，外源性雄激素对BDNF表达的调节是通过VEGF及上皮细胞实现的），并在幼鸟 HVC区域中发现了ER与BDNF共表达的细胞，因而推测E2可能是通过BDNF基因前的雌激素受体应答元件直接调节BDNF基因的转录。. 我们还通过抑制性消减杂交，对幼年鸣禽白腰文鸟(Lonchura striata)雄鸟全脑高表达基因进行筛选，构建消减文库。随机挑取600个克隆，经菌落PCR对其所含EST进行扩增，并从扩增后的PCR产物中随机挑取200个进行反向Northern杂交鉴定其表达的差异性，得到67个在雄鸟脑中高表达的基因，其中24个仅在雄鸟脑中表达。将这67个差异表达基因进行测序和序列比对，其中有7个基因可能定位于Z染色体上。通过测序、比对以及文献查阅和分析最终选取名为小清蛋白（Parvalbumin, PV）的基因进行半定量RT－PCR检测，发现PV在PD15（Posthatchling Day 15）时，雄性端脑中该基因的表达量显著高于雌性。随后通过原位杂交和免疫组织化学方法，检测了PV mRNA以及蛋白在PD15、PD45以及成年（Adult）三个时期白腰文鸟鸣唱系统中的表达情况。根据我们的实验结果推测，同属钙结合蛋白家族中的PV可能在鸣禽鸣唱系统的发育成熟以及性双态产生的过程中发挥一定的作用。

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