多基因表达家蚕生物反应器制备口服轮状病毒-肠道病毒71型双价病毒样颗粒疫苗研究

Both rotavirus and enterovirus71(EV71) mainly infect the infants younger than 5 years old, the former infection results diarrhea and the latter infection causes hand, mouth and foot disease (HMFD). It is necessary to develop a kind of high efficient and safe bivalent vaccine against the two viruses. Our previous study indicated that the rotavirus virus like particles (VLPs) did not elicit high level of systemic and mucosal immune response when using oral inoculation. In this study, we will construct an improved intestinal mucosal immune response rotavirus-EV71 bivalent virus like particles vaccine using our multi-gene expression silkworm bioreactor . We first prepare to produce VLPs with a “spike” formed by rotavirus VP4, which can mimic rotavirus infection. Then we will introduce the factors binding with misfold (M) cells into the VLPs surface to increase the mucosal immune response level. Finally, we will fuse the EV71 VP1with rotavirus VP2 and fuse other 3 epitopes from EV71 VP2,VP3,VP4 with rotavirus VP6 and VP7 to construct the new VLPs which containing the EV71 VP1 inner layer, displaying 2 epitopes in the middle layer and 1 epitope and 1 M cell binding factor on outer layer with a spike. The bivalent virus like particles will be used as a new vaccine against EV71 and rotavirus simultaneously. The study is benefit for the VLPs vaccine design and multivalent or multiple functional vaccines construction.

轮状病毒和肠道病毒71型主要感染5岁以下婴幼儿，分别引起小儿腹泻和手足口病，因此研究抗两种病毒的高效安全的双价疫苗十分必要。前期研究表明轮状病毒样颗粒口服免疫效果不佳，难以获得高水平粘膜免疫和系统免疫反应。本研究拟用多基因表达家蚕生物反应器构建肠粘膜免疫反应增强型轮状病毒-EV71双价病毒样颗粒疫苗。通过构建具有刺突的三层轮状病毒样颗粒模拟真实病毒粒子入侵及将M细胞特异性结合多肽展示在病毒样颗粒表面以增强肠粘膜乃至全身粘膜免疫反应，提高病毒样颗粒的口服免疫效果。通过轮状病毒VP2融合EV71-VP1，将VP1组装进轮状病毒样颗粒内层，同时将来自EV71的VP2、VP3、VP4的表位展示于轮状病毒样颗粒中层和外层，从而获得肠粘膜免疫反应增强型双价病毒样颗粒疫苗，达到同时抗手足口病和轮状病毒感染性腹泻目标。本研究拓展了病毒样颗粒疫苗的设计思路，对构建多价病毒样颗粒口服疫苗具有重要借鉴意义。

人轮状病毒和肠道病毒71型主要感染5岁以下婴幼儿，其分别引起小儿腹泻和手足口病，这两种传染病在我国丙类传染病感染人数排名前三。目前轮状病毒疫苗有二款口服减毒活疫苗，EV71疫苗为一款注射灭活疫苗，尚未有基因工程疫苗上市。因此研究适用于婴幼儿且同时抗两种病毒的高效安全口服型双联疫苗十分必要，其具有很好的应用前景。传统的蛋白亚单位疫苗口服效果差，为了提高双联疫苗的肠粘膜免疫反应水平，根据轮状病毒的结构特点设计出新的嵌合型病毒样颗粒，并对其免疫原性进行系统研究。首先通过杆状病毒多基因表达系统在昆虫细胞内成功表达出嵌合型RV-EV71的三层结构病毒样颗粒。通过电子显微观察、western blot等方法验证该颗粒包含了RV的2,4,6,7 四个结构蛋白，EV71的VP1蛋白和3个中和表位以及M细胞合多肽等关键元件。其次所构建的RV-EV71 嵌合型VLP 能够有效地被肠道M细胞识别并提高其转运效率。通过注射10ug 嵌合型双联VLP，免疫小鼠被诱导出高水平可结合EV和RV的IgG抗体并产生细胞免疫效应、其产生了能同时抑制EV71和RV的高效价中和抗体，说明注射免疫VLP效果显著。攻毒实验结果显示免疫小鼠生产的母源抗体能够对初生乳鼠产生完全保护效果。最后将30ug 嵌合型双联VLP使用口服即胃灌方式免疫初生乳鼠，结果表明携带M细胞结合多肽的VLP的特异性抗体水平比对照显著增加，对EV71和RV病毒免疫保护效率分别达到65%和80%，产生良好的保护效果。嵌合型VLP的表达、装配、检测、免疫原性分析和动物实验结果显示，成功获得了粘膜免疫反应增强型可口服可注射的嵌合型双联病毒样颗粒疫苗，其具有很好的应用前景,达到了预期研究目标。项目执行期间，已发表论文23篇，含SCI期刊论文14篇，中心核心期刊论文9篇，授权发明专利6项。已培养省级特聘教授带1名，教授1名，副教授2名，毕业硕士研究生10名，更多研究成果将在1-2年内陆续发表。

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