VB6对乳腺癌细胞ERα再表达的影响及其逆转内分泌治疗耐药的实验研究

我们在以往实验的基础上筛选出了一个新的化合物VB6(Vitexin compound 6)，其来源于马鞭草科牡荆属植物黄荆(Vitex negundo L. )的果实。初步的研究发现其有抑制ERK/MAPK信号通路，诱导ERα再表达，逆转内分泌治疗耐药的作用。由此我们拟以雌激素受体阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和获得性耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7 TAMR作为研究对象，深入研究VB6对上述两种细胞的生长抑制作用，阐明乳腺癌内分泌耐药机制中MAPK信号通路和ERα基因CpG岛的甲基化情况。通过体内和体外实验，明确VB6在抑制MAPK信号通路和ERα基因CpG岛去甲基化的作用。观察VB6在乳腺癌内分泌治疗耐药细胞株和动物中对他莫昔芬(TAM)治疗的敏感性的影响，明确VB6在逆转内分泌治疗耐药的作用。为临床上乳腺癌内分泌治疗耐药患者提供一种新的治疗方法和手段。

黄荆子乙酸乙酯提取物(Evn-50) 来源于黄荆子(Fructus Viticis Negundo)，本课题组前期对Evn-50抗肿瘤的作用进行了研究，发现Evn-50具有较广谱的抗恶性肿瘤作用，并发现Evn-50通过显著上调Bax/Bcl-2的比值，促进Bax的表达，抑制Bcl-2 的表达而诱导细胞凋亡。VB6又名6-羟基-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)3-羟甲基-7-甲氧基-3，4-二氢(3R，4S)-2-醛基萘，是从Evn-50化合物中分离纯化出来的单体分子。本研究拟对VB6进行抗肿瘤活性研究，探讨VB6体外体内抗肿瘤作用及其可能机制，进一步从分子水平明确VB6对肿瘤相关信号通路的影响，为后续新型抗肿瘤药物的研发奠定实验基础。筛选敏感细胞株，研究VB6在体外对肿瘤细胞的增殖抑制及促进凋亡、自噬作用，并探讨其分子机制，明确其诱导肿瘤细胞发生凋亡、自噬的信号转导途径。同时建立RKO裸鼠荷瘤模型，研究VB6的体内抗肿瘤作用。研究方法：1. 倒置显微镜观察VB6处理MCF-7、RKO细胞后的形态学改变；2. 采用MTT法测定VB6对不同细胞株的生长抑制率，筛选敏感细胞株；3. 透射电镜观察VB6处理MCF-7、RKO细胞后细胞凋亡、自噬形态改变；4. 流式细胞仪分析凋亡细胞百分比及细胞周期改变；5. Western Blot法检测VB6处理MCF-7、RKO细胞后JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、p-Bcl-2、Caspase-3、PARP、Beclin-1、LC3B的表达变化；6. Balb/c-nu雌性裸鼠荷瘤，腹腔给药观察VB6的体内抗肿瘤作用。结果：1. VB6能有效抑制多种人源性肿瘤细胞增殖，具有明显的细胞毒性作用，但细胞株类型不同，其敏感性不同；2. VB6能诱导MCF-7和RKO细胞凋亡，并且细胞凋亡率具有时间和浓度依赖性。能将MCF-7细胞周期阻滞在G2/M期；3. VB6能诱导MCF-7和RKO细胞自噬性死亡；4. VB6通过显著上调Bax/Bcl-2的比值，促进Bax的表达，抑制Bcl-2的表达而诱导细胞发生凋亡；5. VB6通过激活JNK信号通路抑制MCF-7和RKO细胞增殖和诱导细胞凋亡；6. VB6对RKO细胞Balb/c-nu裸鼠移植瘤体积增长有一定的抑制作用，并且实验剂量下VB6对裸鼠未见明显毒副作用。

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