aHIOP大鼠RGC程序性坏死的"Pin1-Calpastatin-Calpain"通路及调控机制研究

Our previous research suggest that necroptosis occurs in retina ganglion cells (RGCs) at the early stage following acute high intra-ocular pressure(aHIOP), receptor interacting protein 3 (RIP3) may play a key role in RGCs necroptosis. However, There are still exist some necroptosis RGCs after knockdown rip3 gene expression using the method of RNAi in our further research. It indicates that an unknown molecular pathway may exist to participate in this process. Therefore, this project try to explore whether the molecular pathway named "Calpain-AIF-Chromatinolysis" participate in non-RIP3 induced necroptosis in RGCs following aHIOP. Based on our previous study and possible "Calpain-AIF-Chromatinolysis" molecular pathway has beed veiled, we further try to demonstrate that whether the key endogenous molecular named calpain in "Calpain-AIF-Chromatinolysis" pathway is regulated by Pin1 via calpastatin phosphorylation. Our research will improve the understanding of molecular mechanism of RGCs necroptosis at the early stage of aHIOP, and provide some theoretical evidence or drug development target to treat with patients suffering in acute high intra-ocular pressure.

有研究显示急性高眼压后早期视网膜节细胞（RGC）出现程序性坏死，受体相互作用蛋白-3（RIP-3）在RGC的程序性坏死分子通路中发挥了重要介导作用，进一步研究发现降低RIP-3的介导作用，并不能完全抑制RGC的程序性坏死，这提示仍有某种未知的分子通路也参与死亡过程。我们的预实验结果提示Calpain-AIF-Chromatinolysis通路可能参与了急性高眼压后早期非"RIP-3"介导的RGC程序性坏死。本项目拟对该假说进行验证，并探索该通路中的关键启动分子Calpain是否受到上游"Pin-1-Calpastatin磷酸化"两个分子层次的负调控。该假说的实验验证将有助于完善急性高眼压后大鼠RGC走向程序性坏死的分子机制，为急性高眼压患者早期视神经保护的药物治疗机理和药物干预靶点提供理论支持和依据。

谷氨酸是二十种必需氨基酸之一，是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，谷氨酸在调节动物的生理、生化功能中具有重要作用，其浓度在中枢神经系统中处于动态平衡中。然而，如果过量的谷氨酸释放或谷氨酸代谢不足将导致神经元死亡，即神经兴奋毒性的发生。谷氨酸兴奋性毒性与青光眼、糖尿病视网膜病变、阿尔茨海默病、亨廷顿病、中风等疾病相关。目前谷氨酸损伤在调控性坏死中的分子机制尚不完全明确，本研究从原代神经元、神经细胞系以及在体动物三个层面上验证CAST/calpain通路在谷氨酸损伤导致的坏死中的调控作用，并进一步且首次验证在谷氨酸导致的神经元坏死中，Pin1为CAST/calpain调控通路的上游关键调控分子。本研究首先通过PI染色和LDH实验显示，谷氨酸能引起原代视网膜神经元调控性坏死，而C2I（calpain2抑制剂）和CAST活性肽的应用可以抑制调控性坏死的发生。Co-IP结果和计算机模拟分子互作表明Pin1可以与CAST结合。Western blot、RT-qPCR和免疫荧光结果显示CAST的活性受Pin1的调节，Juglone（Pin1抑制剂）的应用同样可以抑制调控性坏死的发生，表明Pin1可能为CAST/calpain调控通路的上游关键调控分子。进一步通过RGC-5细胞系结合siRNA方法和流式细胞术，验证Pin1-CAST/calpain2在谷氨酸诱导的视网膜神经元坏死中的调控机制。最后，体内研究进一步证实了Pin1-CAST/calpain2途径在谷氨酸兴奋后大鼠视网膜神经节细胞层和内核层细胞坏死中的作用，此外，fERG结果显示，C2I，CAST肽和Juglone处理后，能在一定程度上恢复谷氨酸诱导的视觉功能损伤。该研究得出的结论是，过量的谷氨酸可能导致Pin1活化/CAST抑制/ calpain2活化介导的视网膜神经元调控性坏死。本研究将为视网膜神经元调控性坏死通路及其调控机制提供新的认识，并将为今后眼科学界在如何挽救视网膜神经性病变调控性坏死的神经元以及探索药物干预靶点方面提供理论依据。

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